Protein G琼脂糖凝胶CS-01F98007_上海莼试生物技术有限公司

产品详情

一、概述：

产品属性：

产品名称	英文名称	规格	货号
Protein G琼脂糖凝胶	Protein G-Sepharose	5ml	CS-01F98007

本产品为Protein G与Sepharose偶联后产物，可从血清，腹水，细胞培养上清和细胞抽提物中分离和纯化多种哺乳动物丌同亚型的抗体或包含抗体Fc片段的基因工程重组蛋白。Protein G是链球菌(group C和G)细胞表面蛋白。它不Protein A类似，通过不免疫球蛋白的Fc区相互作用，可结合大多数哺乳动物的IgG。但两者结合特异性有所丌同。Protein G对人IgG3，小鼠IgG1，大鼠IgG2a等具有高亲和力。天然Protein G具有白蛋白和细胞表面结合域。重组Protein G去除了白蛋白和细胞表面结合域，以减少非特异性结合。本产品具有广谱 IgG结合、高Fc段结合活性、高抗体吸附量和性能稳定等特点，可重复多次使用。

注意事项：

1、凝胶从冷室或冰箱中取出后在室温下缓慢振摇恢复到室温后装柱，避免产生气泡影响柱效。

2、装柱时尽可能维持凝胶长径比为5:3-2:1，长径比过大将导致洗脱峰拖尾，洗脱体积增大；长径比过小将导致样品与填料接触时间短，吸附不充分，填料吸附蛋白量小。

3、若上样液中抗体浓度过高，应使用平衡缓冲液稀释至1-2 mg/ml，以免上样浓度过高影响柱效。

4、可以采用降低上样时的流速来增加样品与填料接触时间从而提高纯化抗体量。

5、凝胶用低pH缓冲液洗脱时间应尽可能短，洗脱后用中性缓冲液尽快中和至pH中性，以延长亲和介质的使用寿命。

6、洗脱后，应立刻用如中和缓冲液将收集到的抗体溶液中和到中性(pH7.4左右)，以利于维持抗体的生物活性，避免抗体失活。

7、填料使用后应用0.1 M柠檬酸钠缓冲液(pH3.0)做再生处理，长期采用的洗脱条件将缩短亲和介质的使用寿命。
储存条件：2～8℃，避免冷冻

实验步骤：

(1)实验开始前将RNA提取液于65℃水浴锅中预热,离心管中加入ME(巯基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取约0.8g菌丝体(液体培养获得的菌丝用真空抽滤即可！固体培养就更好说了),在液氮中迅速磨成精细粉末,装入50mL离心管,按1g材料8mL的量加入预热的RNA提取液,颠倒混匀

(3)65℃水浴3-10 min,期间混匀2-3次

(4)加入等体积的酚(注意是酸酚pH4.5)::异戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等体积的:异戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V体积10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或过夜)

(7)10,000rpm,4℃离心20min

(8)弃上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::异戊醇(25:24:1)抽提两次,:异戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V体积的无水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃离心20 min

(12)弃上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC处理水溶解

(14)用非变性琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计扫描检测RNA的质量

(在抽提过程中,若蛋白质含量或其它的杂质还较多,可以增加抽提次数)

操作步骤:

1. 匀浆处理:a.组织将组织在液氮中磨碎,每50-100mg组织加入1ml TRIzol,用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过TRIzol体积10℅。

b.单层培养细胞直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞，每10cm2面积(即3.5cm直径的培养板)加1ml，用移液器吸打几次。TRIzol的用量应根据培养板面积而定，不取决于细胞数。TRIzol加量不足可能导致提取的RNA有DNA污染。

c．细胞悬液离心收集细胞，每5-10×106动物、植物、酵母细胞或1×107细菌细胞加入1ml TRIzol，反复吸打。加TRIzol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。产品仅用于科研

2．将匀浆样品在室温（15-30℃）放置5分钟，使核酸蛋白复合物完全分离。

3．可选步骤：如样品中含有较多蛋白质，脂肪，多糖或胞外物质（肌肉，植物结节部分等）可于2-8℃10000×g离心10分钟，取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。处理脂肪组织时，上层有大量油脂应去除。取澄清的匀浆液进行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，剧烈振荡15秒，室温放置3分钟。

6. 2-8℃10000×g离心15分钟。样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIzol试剂的60℅。

7. 把水相转移到新管中，如要分离DNA和蛋白质可保留有机相，进一步操作见后。用异丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml异丙醇，室温放置10分钟。

8. 2-8℃10000×g离心10分钟，离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。

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