产品属性: 产品名称 | 英文名称 | 规格 | 货号 |
细胞冻存液 | Cell Culture Freezing Medium | 50ml | CS-01F97988 |
本品是一种即用型的培养细胞低温冻存液,适用于绝大部分的哺乳动物细胞冻存。如果每管细胞使用1ml细胞冻存液,一个包装的本产品可以用于约50管细胞的冻存。
本产品是即用型的无菌溶液,待冻存的细胞收集后,加入适量冻存液混匀即可,无需自行配制任何溶液,使用非常便捷。
细胞冻存是细胞保存的主要方法之一。利用冻存技术将细胞置于-196℃的液氮中低温保存,可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性长期保存起来,在需要的时候再复苏细胞用于实验。同时适度地冻存一定量的细胞,可以防止因细胞被污染或其它意外事件而使细胞无法继续培养,起到了细胞保种的作用。 细胞冻存和复苏一般采用“慢冻快融”的方法,该方法能较好地保证细胞存活率。 本细胞冻存液包含了细胞冻存所需的所有组分,主要成分是高糖DMEM、适量澳洲进口优质胎牛血清及DMSO等,并在此基础上优化了相关组分,可大大提高复苏时细胞的存活率。 注意事项: 1. 使用前需确保细胞冻存液完全融化,并轻轻混匀。融化后的细胞冻存液置于4℃保存。 2. 请确保冻存前细胞生长情况良好,例如处于对数生长期的细胞,并且冻存时存活率大于90%。 3. 建议细胞冻存在液氮中,可以长时间进行保存。如果置于-80℃保存,保存时间大约为1年。 4. 请使用耐受有机溶剂的marker笔进行标记,以防做的标记被酒精或异丙醇等有机溶剂擦掉,而不能辨识。 储存条件:-20℃,有效期12个月。 |
实验步骤:
(1)实验开始前将RNA提取液于65℃水浴锅中预热,离心管中加入ME(巯基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)
(2)取约0.8g菌丝体(液体培养获得的菌丝用真空抽滤即可!固体培养就更好说了),在液氮中迅速磨成精细粉末,装入50mL离心管,按1g材料8mL的量加入预热的RNA提取液,颠倒混匀
(3)65℃水浴3-10 min,期间混匀2-3次
(4)加入等体积的酚(注意是酸酚pH4.5)::异戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(5)取上清,等体积的:异戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(6)加入1/4V体积10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或过夜)
(7)10,000rpm,4℃离心20min
(8)弃上清,用500ul SSTE溶解沉淀
(9)酚::异戊醇(25:24:1)抽提两次,:异戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)
(10)加2V体积的无水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上
(11)12,000rpm,4℃离心20 min
(12)弃上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥
(13)加200ul的DEPC处理水溶解
(14)用非变性琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计扫描检测RNA的质量
(在抽提过程中,若蛋白质含量或其它的杂质还较多,可以增加抽提次数)
操作步骤:
1. 匀浆处理:a.组织 将组织在液氮中磨碎,每50-100mg组织加入1ml TRIzol,用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过TRIzol体积10℅。
b.单层培养细胞 直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞,每10cm2面积(即3.5cm直径的培养板)加1ml,用移液器吸打几次。TRIzol的用量应根据培养板面积而定,不取决于细胞数。TRIzol加量不足可能导致提取的RNA有DNA污染。
c.细胞悬液 离心收集细胞,每5-10×106动物、植物、酵母细胞或1×107细菌细胞加入1ml TRIzol,反复吸打。加TRIzol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。产品仅用于科研
2.将匀浆样品在室温(15-30℃)放置5分钟,使核酸蛋白复合物完全分离。
3.可选步骤:如样品中含有较多蛋白质,脂肪,多糖或胞外物质(肌肉,植物结节部分等)可于2-8℃10000×g离心10分钟,取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜,多糖,高分子量DNA,上清中含有RNA。处理脂肪组织时,上层有大量油脂应去除。取澄清的匀浆液进行下一步操作。
5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml,剧烈振荡15秒,室温放置3分钟。
6. 2-8℃10000×g离心15分钟。样品分为三层:底层为黄色有机相,上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中,水相体积约为所用TRIzol试剂的60℅。
7. 把水相转移到新管中,如要分离DNA和蛋白质可保留有机相,进一步操作见后。用异丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml异丙醇,室温放置10分钟。
8. 2-8℃10000×g离心10分钟,离心前看不出RNA沉淀,离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。