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分子生物学试剂 > 克隆与表达 > pTG-T载体连接试剂盒
产品名称:
pTG-T载体连接试剂盒
型号:
CS-01F97857
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产品简介
pTG-T载体连接试剂盒现货供应,价格实惠。
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一、概述:

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pTG-T载体连接试剂盒

pTG-T Vector Ligation Kit

20|60

CS-01F97857

本试剂盒适用于PCR产物的克隆,可将PCR产物连接到pTG-T载体上,便于进行下一步实验。DNA片段连接是经常出问题的步骤,为了提高连接效率,本试剂盒提供了两种连接Buffer供不同情况选择:10×Ligation Buffer Ⅰ适合置于16℃连接过夜,可获得佳连接效果;2×Ligation Buffer Ⅱ为快速连接Buffer25℃连接10分钟即可转化,快捷方便。

英文名称:pTG-T Vector Ligation Kit

产品规格:20|60

本试剂盒适用于PCR产物的克隆,可将PCR产物连接到pTG-T载体上,便于进行下一步实验。DNA片段连接是经常出问题的步骤,为了提高连接效率,本试剂盒提供了两种连接Buffer供不同情况选择:10×Ligation Buffer Ⅰ适合置于16℃连接过夜,可获得佳连接效果;2×Ligation Buffer Ⅱ为快速连接Buffer25℃连接10分钟即可转化,快捷方便。

pTG-T是一种高效克隆PCR产物的专用载体,它是由一种克隆载体在EcoRV酶切位点处切开,在两侧的3′端添加T而成。由于大部分耐热聚合酶反应时都会在PCR产物的3′端添加一个A,可与pTG-T 3′端的T互补连接,因此可大大提高PCR产物的连接和克隆效率。连接使用的PCR片段3′端应带有A末端,如果是使用pfu等高保真聚合酶扩增的不带A末端的片段,应使用平末端连接试剂盒先加A末端后再连接。

带有插入片段的重组子可根据α互补原理,进行蓝白斑筛选,判断载体中有无外源基因的插入(白色克隆为阳性重组克隆,蓝色的为载体自连的克隆,具体筛选原理参考分子克隆等书籍)。克隆后,可使用通用引物T7SP6进行测序。
保存条件:-20℃保存,避免反复冻融(载体和连接试剂可以适当的分装成小份,防止反复冻融,以保证质量)。

实验步骤:
(1)实验开始前将RNA提取液于65℃水浴锅中预热,离心管中加入ME(巯基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)
(2)取约0.8g菌丝体(液体培养获得的菌丝用真空抽滤即可!固体培养就更好说了),在液氮中迅速磨成精细粉末,装入50mL离心管,按1g材料8mL的量加入预热的RNA提取液,颠倒混匀  
(3)65℃水浴3-10 min,期间混匀2-3次
(4)加入等体积的酚(注意是酸酚pH4.5)::异戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(5)取上清,等体积的:异戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(6)加入1/4V体积10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或过夜)
(7)10,000rpm,4℃离心20min
(8)弃上清,用500ul SSTE溶解沉淀
(9)酚::异戊醇(25:24:1)抽提两次,:异戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)
(10)加2V体积的无水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上
(11)12,000rpm,4℃离心20 min
(12)弃上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥
(13)加200ul的DEPC处理水溶解
(14)用非变性琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计扫描检测RNA的质量
(在抽提过程中,若蛋白质含量或其它的杂质还较多,可以增加抽提次数)
操作步骤:
1. 匀浆处理:a.组织 将组织在液氮中磨碎,每50-100mg组织加入1ml TRIzol,用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过TRIzol体积10℅。
b.单层培养细胞 直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞,每10cm2面积(即3.5cm直径的培养板)加1ml,用移液器吸打几次。TRIzol的用量应根据培养板面积而定,不取决于细胞数。TRIzol加量不足可能导致提取的RNA有DNA污染。
c.细胞悬液 离心收集细胞,每5-10×106动物、植物、酵母细胞或1×107细菌细胞加入1ml TRIzol,反复吸打。加TRIzol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。产品仅用于科研
2.将匀浆样品在室温(15-30℃)放置5分钟,使核酸蛋白复合物完全分离。
3.可选步骤:如样品中含有较多蛋白质,脂肪,多糖或胞外物质(肌肉,植物结节部分等)可于2-8℃10000×g离心10分钟,取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜,多糖,高分子量DNA,上清中含有RNA。处理脂肪组织时,上层有大量油脂应去除。取澄清的匀浆液进行下一步操作。
5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml,剧烈振荡15秒,室温放置3分钟。
6. 2-8℃10000×g离心15分钟。样品分为三层:底层为黄色有机相,上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中,水相体积约为所用TRIzol试剂的60℅。
7. 把水相转移到新管中,如要分离DNA和蛋白质可保留有机相,进一步操作见后。用异丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml异丙醇,室温放置10分钟。
8. 2-8℃10000×g离心10分钟,离心前看不出RNA沉淀,离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。

标签:pTG-T载体连接试剂盒 20次 60次 

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