T载体PCR产物克隆试剂盒CS-01F97852_上海莼试生物技术有限公司

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一、概述：

产品属性：

产品名称	英文名称	规格	货号
T载体PCR产物克隆试剂盒	T Vector PCR Products Cloning Kit	20次\|100次	CS-01F97852

本试剂盒适用于克隆带有3'-末端A突出的PCR产物的克隆。本试剂盒提供的独特连接系统允许用户在1小时的时间里完成连接反应。

英文名称：T Vector PCR Products Cloning Kit

产品规格：20次|100次

本试剂盒适用于克隆带有3'-末端A突出的PCR产物的克隆。本试剂盒提供的独特连接系统允许用户在1小时的时间里完成连接反应。

本公司的pUCm-T载体是为简化PCR产物的克隆而设计的。许多高温DNA聚合酶，如Taq DNA聚合酶、Tth DNA聚合酶等扩增的PCR产物在3'-末端后都带有一个突出的碱基A，这样的PCR产物可以用3'-末端后带有一个突出碱基T的载体方便地进行克隆。

pUCm-T是一种新颖的pUC系列T载体，其多克隆位点更多的单切点和β-半乳糖苷酶阅读框架的调整大大方便了克隆的蓝/白筛选。插入位点两端独特设计的两个PstI位点使插入片段可以用Pst I单酶切进行检测，也可以用非常廉价而高效的EcoR I和Hind III双酶切进行检测。可以用M13通用引物和T7启动子引物对PCR产物进行测序。pUCm-T含有T7 RNA聚合酶的启动子，可以对插入片段进行体外转录。

本说明结尾处列出了pUCm-T相关的技术资料，其全序列可参照pUC19（GenBank Accession Number M77789），只是其多克隆位点部分的序列有所不同.
保存：-20℃保存

实验步骤：

(1)实验开始前将RNA提取液于65℃水浴锅中预热,离心管中加入ME(巯基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取约0.8g菌丝体(液体培养获得的菌丝用真空抽滤即可！固体培养就更好说了),在液氮中迅速磨成精细粉末,装入50mL离心管,按1g材料8mL的量加入预热的RNA提取液,颠倒混匀

(3)65℃水浴3-10 min,期间混匀2-3次

(4)加入等体积的酚(注意是酸酚pH4.5)::异戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等体积的:异戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V体积10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或过夜)

(7)10,000rpm,4℃离心20min

(8)弃上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::异戊醇(25:24:1)抽提两次,:异戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V体积的无水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃离心20 min

(12)弃上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC处理水溶解

(14)用非变性琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计扫描检测RNA的质量

(在抽提过程中,若蛋白质含量或其它的杂质还较多,可以增加抽提次数)

操作步骤:

1. 匀浆处理:a.组织将组织在液氮中磨碎,每50-100mg组织加入1ml TRIzol,用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过TRIzol体积10℅。

b.单层培养细胞直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞，每10cm2面积(即3.5cm直径的培养板)加1ml，用移液器吸打几次。TRIzol的用量应根据培养板面积而定，不取决于细胞数。TRIzol加量不足可能导致提取的RNA有DNA污染。

c．细胞悬液离心收集细胞，每5-10×106动物、植物、酵母细胞或1×107细菌细胞加入1ml TRIzol，反复吸打。加TRIzol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。产品仅用于科研

2．将匀浆样品在室温（15-30℃）放置5分钟，使核酸蛋白复合物完全分离。

3．可选步骤：如样品中含有较多蛋白质，脂肪，多糖或胞外物质（肌肉，植物结节部分等）可于2-8℃10000×g离心10分钟，取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。处理脂肪组织时，上层有大量油脂应去除。取澄清的匀浆液进行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，剧烈振荡15秒，室温放置3分钟。

6. 2-8℃10000×g离心15分钟。样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIzol试剂的60℅。

7. 把水相转移到新管中，如要分离DNA和蛋白质可保留有机相，进一步操作见后。用异丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml异丙醇，室温放置10分钟。

8. 2-8℃10000×g离心10分钟，离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。

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