pET-N-GST-Thrombin-C-His质粒CS-01F97824_上海莼试生物技术有限公司

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一、概述：

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产品名称	英文名称	规格	货号
pET-N-GST-Thrombin-C-His质粒	pET-N-GST-Thrombin-C-His Plasmid	1μg\|100μg	CS-01F97824

pET-N-GST-Thrombin-C-His是一种用于表达N端含GST标签(Glutathione S-transferase tag,GST tag)或C端含His标签(His tag)的重组蛋白的原核表达质粒，也可用于表达N端含GST标签并且同时C端含His标签的重组蛋白。GST和His双标签有利于通过GST柱和镍柱两种方法来纯化目的蛋白，使目的蛋白的纯度更高。本质粒N端GST标签后有Thrombin酶切位点，可通过Thrombin蛋白酶切除N端的GST标签。本质粒为卡那抗性。

本质粒含有T7启动子/lac操纵子，可以在异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)的诱导下高效启动目的蛋白表达。在多克隆位点的前面有一个GST标签的编码序列，后面有一个His标签的编码序列，后者含有6个组(6X His)。因此在多克隆位点根据读码框插入不含终止密码子的目的基因就可以表达N端含有GST标签并且C端含有His标签的目的蛋白。也可以在目的基因后面添加终止密码子，这样就可以表达仅在N端含有GST标签的目的蛋白。如果在NdeI和多克隆酶切位点之间按照读码框插入不带有终止密码子的目的基因，这样就可以表达仅C端带有His标签的目的蛋白。

本载体在N端GST标签与多克隆位点之间含有Thrombin蛋白酶识别的6肽序列LVPRGS，对应的核酸序列为CTGGTTCCGCGTGGATCC，因此在目的蛋白纯化后可以利用Thrombin酶切除N端的GST标签。Thrombin蛋白酶酶切发生在六肽序列的R和G之间，因此在酶切去除GST标签的时候会在目的蛋白的N端留下两个额外的氨基酸残基GS。

通常可以采用如GoldBalb GST-tag Purification Resin(YT958)、GST标签蛋白纯化试剂盒(YT959)、GoldBalb His-tag Purification Resin(YT616)或His标签蛋白纯化试剂盒(YT046)等纯化本质粒表达的目的蛋白，也可以使用GST抗体(YT784/YT722)和His-tag抗体(YT789)检测和少量地分离纯化目的蛋白。

使用说明：

1．使用1μg包装的本产品时，请先取少量本质粒转化大肠杆菌，进行质粒小量、中量或大量抽提后再用于后续用途。抽提获得的质粒可以通过酶切电泳进行鉴定，或通过测序进行鉴定。

2．100μg包装的本产品质粒浓度为0.1μg/μl，共1ml。可以直接用于酶切或者转染细胞。

3．pET-N-GST-Thrombin-C-His质粒在其多克隆位点适当酶切后可以插入待表达的目的基因，构建的质粒可以用常规方法转入表达菌株。标签并且C端含有His标签的目的蛋白。也可以在目的基因后面添加终止密码子，这样就可以表达仅在N端含有GST标签的目的蛋白。如果在NdeI和多克隆酶切位点之间按照读码框插入不带有终止密码子的目的基因，这样就可以表达仅C端带有His标签的目的蛋白。

使用说明：

2．100μg包装的本产品质粒浓度为0.1μg/μl，共1ml。可以直接用于酶切或者转染细胞。

3．pET-N-GST-Thrombin-C-His质粒在其多克隆位点适当酶切后可以插入待表达的目的基因，构建的质粒可以用常规方法转入表达菌株。

实验步骤：

(1)实验开始前将RNA提取液于65℃水浴锅中预热,离心管中加入ME(巯基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取约0.8g菌丝体(液体培养获得的菌丝用真空抽滤即可！固体培养就更好说了),在液氮中迅速磨成精细粉末,装入50mL离心管,按1g材料8mL的量加入预热的RNA提取液,颠倒混匀

(3)65℃水浴3-10 min,期间混匀2-3次

(4)加入等体积的酚(注意是酸酚pH4.5)::异戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等体积的:异戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V体积10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或过夜)

(7)10,000rpm,4℃离心20min

(8)弃上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::异戊醇(25:24:1)抽提两次,:异戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V体积的无水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃离心20 min

(12)弃上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC处理水溶解

(14)用非变性琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计扫描检测RNA的质量

(在抽提过程中,若蛋白质含量或其它的杂质还较多,可以增加抽提次数)

操作步骤:

1. 匀浆处理:a.组织将组织在液氮中磨碎,每50-100mg组织加入1ml TRIzol,用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过TRIzol体积10℅。

b.单层培养细胞直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞，每10cm2面积(即3.5cm直径的培养板)加1ml，用移液器吸打几次。TRIzol的用量应根据培养板面积而定，不取决于细胞数。TRIzol加量不足可能导致提取的RNA有DNA污染。

c．细胞悬液离心收集细胞，每5-10×106动物、植物、酵母细胞或1×107细菌细胞加入1ml TRIzol，反复吸打。加TRIzol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。产品仅用于科研

2．将匀浆样品在室温（15-30℃）放置5分钟，使核酸蛋白复合物完全分离。

3．可选步骤：如样品中含有较多蛋白质，脂肪，多糖或胞外物质（肌肉，植物结节部分等）可于2-8℃10000×g离心10分钟，取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。处理脂肪组织时，上层有大量油脂应去除。取澄清的匀浆液进行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，剧烈振荡15秒，室温放置3分钟。

6. 2-8℃10000×g离心15分钟。样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIzol试剂的60℅。

7. 把水相转移到新管中，如要分离DNA和蛋白质可保留有机相，进一步操作见后。用异丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml异丙醇，室温放置10分钟。

8. 2-8℃10000×g离心10分钟，离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。

标签：pET-N-GST-Thrombin-C-His质粒 1μg 100μg

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