His和SUMO双标签质粒CS-01F97807_上海莼试生物技术有限公司

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一、概述：

产品属性：

产品名称	英文名称	规格	货号
His和SUMO双标签质粒	pET-N-His-PreScission-SUMO	1μg\|100μg	CS-01F97807

本制品是一种用于表达N端同时含有His标签(His tag)和SUMO标签(SUMO tag)双标签的目的蛋白的原核表达质粒。His标签有利于通过亲和层析方法进行目的蛋白的纯化，而SUMO标签则有利于改善目的蛋白的折叠，增加目的蛋白可溶性和产量。表达后的含有目的蛋白的融合蛋白可以通过PreScission蛋白酶酶切去除His标签但保留SUMO标签，也可以通过SUMO Protease 酶切去除N端的His和SUMO两个标签。本质粒为卡那抗性。

如果通过无缝克隆技术(Seamless Cloning Kit，无缝克隆试剂盒)在SUMO标签酶切位点后插入目的蛋白ATG起始的序列，SUMO Protease酶切后，可以确保表达的目的蛋白氨基端(N端)刚好从甲硫(Methione)开始，不会增加或减少任何一个氨基酸，实现目的蛋白的正确表达。

本质粒含有T7启动子/lac操纵子，可以在异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)的诱导下高效启动目的蛋白表达。在多克隆位点根据读码框插入目的基因就可以表达N端含有His和SUMO双标签的目的蛋白。

本载体在N端His标签后含有PreScission Protease识别的八肽序列LEVLFQGP，因此在目的蛋白纯化后可以利用PreScission Protease酶切除去N端的His标签，但在SUMO融合蛋白的N端还会保留两个额外的氨基酸GP。在用SUMO Protease酶切除去SUMO标签的时候，SUMO Protease识别的是SUMO蛋白的空间结构，通过无缝克隆的方式在CAGATTGGTGGA (对应氨基酸为QIGG)序列后插入目的蛋白的基因序列，在用SUMO Protease进行酶切的时候，其正好在QIGG后产生酶切，因此可以产生不带任何额外氨基酸的目的蛋白，而这是很多做蛋白结构和功能研究的研究人员所梦寐以求的。

可以采用如His-tag Purification Resin(耐还原螯合型) /His标签蛋白纯化试剂盒(耐还原螯合型) (货号YT046)以及His-tag Purification Resin(变性剂耐受型) /His标签蛋白纯化试剂盒(变性剂耐受型)等纯化本质粒表达的目的蛋白，也可以使用His-tag抗体检测或少量分离纯化目的蛋白。

使用说明：

使用1μg包装的本产品时，请先取少量本质粒转化大肠杆菌，进行质粒小量、中量或大量抽提后再用于后续用途。抽提获得的质粒可以通过酶切电泳进行鉴定，或通过测序进行鉴定。

100μg包装的本产品质粒浓度为0.1μg/μl，共1ml。可以直接用于酶切或者转染细胞。
pET-N-His-PreScission-SUMO质粒在其多克隆位点适当酶切后可以插入待表达的目的基因，或者也可以同无缝克隆技术在SUMO标签之后插入目的基因，构建的质粒可以用常规方法转入表达菌株进行表达纯化。

实验步骤：

(1)实验开始前将RNA提取液于65℃水浴锅中预热,离心管中加入ME(巯基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取约0.8g菌丝体(液体培养获得的菌丝用真空抽滤即可！固体培养就更好说了),在液氮中迅速磨成精细粉末,装入50mL离心管,按1g材料8mL的量加入预热的RNA提取液,颠倒混匀

(3)65℃水浴3-10 min,期间混匀2-3次

(4)加入等体积的酚(注意是酸酚pH4.5)::异戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等体积的:异戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V体积10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或过夜)

(7)10,000rpm,4℃离心20min

(8)弃上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::异戊醇(25:24:1)抽提两次,:异戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V体积的无水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃离心20 min

(12)弃上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC处理水溶解

(14)用非变性琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计扫描检测RNA的质量

(在抽提过程中,若蛋白质含量或其它的杂质还较多,可以增加抽提次数)

操作步骤:

1. 匀浆处理:a.组织将组织在液氮中磨碎,每50-100mg组织加入1ml TRIzol,用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过TRIzol体积10℅。

b.单层培养细胞直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞，每10cm2面积(即3.5cm直径的培养板)加1ml，用移液器吸打几次。TRIzol的用量应根据培养板面积而定，不取决于细胞数。TRIzol加量不足可能导致提取的RNA有DNA污染。

c．细胞悬液离心收集细胞，每5-10×106动物、植物、酵母细胞或1×107细菌细胞加入1ml TRIzol，反复吸打。加TRIzol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。产品仅用于科研

2．将匀浆样品在室温（15-30℃）放置5分钟，使核酸蛋白复合物完全分离。

3．可选步骤：如样品中含有较多蛋白质，脂肪，多糖或胞外物质（肌肉，植物结节部分等）可于2-8℃10000×g离心10分钟，取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。处理脂肪组织时，上层有大量油脂应去除。取澄清的匀浆液进行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，剧烈振荡15秒，室温放置3分钟。

6. 2-8℃10000×g离心15分钟。样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIzol试剂的60℅。

7. 把水相转移到新管中，如要分离DNA和蛋白质可保留有机相，进一步操作见后。用异丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml异丙醇，室温放置10分钟。

8. 2-8℃10000×g离心10分钟，离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。

标签：His和SUMO双标签质粒 1μg 100μg

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