零背景TA克隆试剂盒(Amp抗性)CS-01F97776_上海莼试生物技术有限公司

产品详情

一、概述：

产品属性：

产品名称	英文名称	规格	货号
零背景TA克隆试剂盒(Amp抗性)	TA Cloning Kit(Resistance to Ampicillin)	25次	CS-01F97776

本产品是基于Topoisomerase能够在几秒钟之内高速连接DNA片段的原理开发的无背景克隆试剂盒，它使用了本公司通过定点突变改良的TOPO酶，连接效率比野生型更高。

产品特点：

1. 高效快速，连接反应几乎在几秒钟内完成，连接率几乎达到100%。

2. 适用于具有A尾巴的DNA片段使用。

3. 无杂带或引物二聚体的PCR扩增产物可以不经过纯化直接用于连接反应。

4. 转化时只需要37℃10分钟复苏即可涂盘，免去冰浴、热休克和复苏步骤。

5. 零背景，无需IPTG-X-Gal蓝白斑筛选，故不需要IPTG-X-Gal培养基。

6. 本试剂盒按10μl标准反应体系。

7. 提供含Amp和Kan两种抗性的载体供选择（BTN160686A是含Amp抗性TOPO载体，BTN60686K是含Kan抗性TOPO载体）。

保存条件：-20℃，有效期一年。

自备试剂：DNA插入片段、感受态细胞、SOC或LB培养基和培养皿（含抗菌素和不含的）用于具有A尾巴的DNA片段使用。

3. 无杂带或引物二聚体的PCR扩增产物可以不经过纯化直接用于连接反应。

4. 转化时只需要37℃10分钟复苏即可涂盘，免去冰浴、热休克和复苏步骤。

5. 零背景，无需IPTG-X-Gal蓝白斑筛选，故不需要IPTG-X-Gal培养基。

6. 本试剂盒按10μl标准反应体系。

7. 提供含Amp和Kan两种抗性的载体供选择（BTN160686A是含Amp抗性TOPO载体，BTN60686K是含Kan抗性TOPO载体）。
保存条件：-20℃，有效期一年。

实验步骤：

(1)实验开始前将RNA提取液于65℃水浴锅中预热,离心管中加入ME(巯基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取约0.8g菌丝体(液体培养获得的菌丝用真空抽滤即可！固体培养就更好说了),在液氮中迅速磨成精细粉末,装入50mL离心管,按1g材料8mL的量加入预热的RNA提取液,颠倒混匀

(3)65℃水浴3-10 min,期间混匀2-3次

(4)加入等体积的酚(注意是酸酚pH4.5)::异戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等体积的:异戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V体积10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或过夜)

(7)10,000rpm,4℃离心20min

(8)弃上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::异戊醇(25:24:1)抽提两次,:异戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V体积的无水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃离心20 min

(12)弃上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC处理水溶解

(14)用非变性琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计扫描检测RNA的质量

(在抽提过程中,若蛋白质含量或其它的杂质还较多,可以增加抽提次数)

操作步骤:

1. 匀浆处理:a.组织将组织在液氮中磨碎,每50-100mg组织加入1ml TRIzol,用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过TRIzol体积10℅。

b.单层培养细胞直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞，每10cm2面积(即3.5cm直径的培养板)加1ml，用移液器吸打几次。TRIzol的用量应根据培养板面积而定，不取决于细胞数。TRIzol加量不足可能导致提取的RNA有DNA污染。

c．细胞悬液离心收集细胞，每5-10×106动物、植物、酵母细胞或1×107细菌细胞加入1ml TRIzol，反复吸打。加TRIzol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。产品仅用于科研

2．将匀浆样品在室温（15-30℃）放置5分钟，使核酸蛋白复合物完全分离。

3．可选步骤：如样品中含有较多蛋白质，脂肪，多糖或胞外物质（肌肉，植物结节部分等）可于2-8℃10000×g离心10分钟，取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。处理脂肪组织时，上层有大量油脂应去除。取澄清的匀浆液进行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，剧烈振荡15秒，室温放置3分钟。

6. 2-8℃10000×g离心15分钟。样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIzol试剂的60℅。

7. 把水相转移到新管中，如要分离DNA和蛋白质可保留有机相，进一步操作见后。用异丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml异丙醇，室温放置10分钟。

8. 2-8℃10000×g离心10分钟，离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。

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