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产品名称:
Rosetta(DE3)感受态细胞
型号:
CS-01F97751
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国产
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产品简介
Rosetta(DE3)感受态细胞现货供应,价格实惠。
产品详情

一、概述:

产品属性: 

产品名称

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规格

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RosettaDE3)感受态细胞

RosettaDE3) Competent E.coli

100 μl×5|100 μl×10

CS-01F97751

本制品是采用大肠杆菌Rosetta DE3)菌株经特殊工艺处理得到的感受态细胞,可用于DNA的化学转化。使用pUC19质粒检测,转化效率可达107cfu/μg DNA-70℃保存几个月转化效率不发生改变。每支感受态可以酌情分装使用,降低了实验的成本。质量稳定,使用方便,质优价廉。

基因型:F- ompT hsdSBrB- mB-) gal dcmDE3 pRAREargU,argW,ilex,glyT,leuW,proL)Camr)

产品特点:

·具有氯抗性。

·该菌适合于非毒性蛋白的表达。

·整合大肠杆菌缺乏的6种稀有密码子所对应的tRNA,适合真核基因在原核系统中的表达。

注意事项:

1.感受态细胞应保存在-70℃,不可冻融和放置时间过长,以避免降低感受态细胞的转化效率。

2.进行转化操作时,应根据相应温度及无菌条件的要求进行。

3.为防止转化实验不成功,可以保留部分连接反应液,以重新转化,将损失降到低。

操作步骤:(以下操作均按无菌条件的标准进行)

1.取感受态细胞置于冰浴中,如需分装可将刚融化细胞悬液分装到无菌预冷的离心管中,置于冰浴中。

注意:一次转化感受态细胞的建议用量为50-100μl,可以根据实际情况分装使用。应注意所用DNA体积不要过感受态细胞悬液体积的十分之一。以下实验以100μl感受态细胞为例。

2.向感受态细胞悬液中加入目的DNA100μl的感受态细胞能够被1ng螺旋质粒DNA所饱和),轻弹混匀,在冰浴中静置30min

3.将离心管置于42℃水浴中放置60-90 sec,然后快速将管转移到冰浴中,使细胞冷却2-3 min,该过程不要摇动离心管。

注意:此步骤也可将离心管置于室温进行,时间不需十分准确,夏季或室温较高时,可放置5-8 min左右,如果室温较低,可延长时间至8-15 min左右。条件允许建议使用42℃热激方法。

4.向每个离心管中加入900 μl无菌的SOCLB培养基(不含抗生素),混匀后置于37℃摇床振荡培养45 min150rpm),目的是使质粒上相关的抗性标记基因表达,使菌体复苏。

5.将离心管内容物混匀,吸取100μl已转化的感受态细胞加到含相应抗生素的SOBLB固体琼脂培养基上,用无菌的弯头玻棒轻轻的将细胞均匀涂开。将平板置于室温直至液体被吸收,倒置平板,37℃培养12-16h

注意:涂布用量可根据具体实验来调整。如转化的DNA总量较多,可取更少量转化产物涂布平板;反之,如转化的DNA总量较少,可取200-300 μl转化产物涂布平板。如果预计的克隆较少,可通过离心(4000 rpm,2 min)后吸除部分培养液,悬浮菌体后将其涂布于一个平板中。(涂布剩余的菌液可置于4℃保存,如果次日的转化菌落数过少可以将剩下的菌液再涂布新的培养板)
保存条件:-70℃冻存,有效期6个月。

实验步骤:
(1)实验开始前将RNA提取液于65℃水浴锅中预热,离心管中加入ME(巯基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)
(2)取约0.8g菌丝体(液体培养获得的菌丝用真空抽滤即可!固体培养就更好说了),在液氮中迅速磨成精细粉末,装入50mL离心管,按1g材料8mL的量加入预热的RNA提取液,颠倒混匀  
(3)65℃水浴3-10 min,期间混匀2-3次
(4)加入等体积的酚(注意是酸酚pH4.5)::异戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(5)取上清,等体积的:异戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(6)加入1/4V体积10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或过夜)
(7)10,000rpm,4℃离心20min
(8)弃上清,用500ul SSTE溶解沉淀
(9)酚::异戊醇(25:24:1)抽提两次,:异戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)
(10)加2V体积的无水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上
(11)12,000rpm,4℃离心20 min
(12)弃上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥
(13)加200ul的DEPC处理水溶解
(14)用非变性琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计扫描检测RNA的质量
(在抽提过程中,若蛋白质含量或其它的杂质还较多,可以增加抽提次数)
操作步骤:
1. 匀浆处理:a.组织 将组织在液氮中磨碎,每50-100mg组织加入1ml TRIzol,用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过TRIzol体积10℅。
b.单层培养细胞 直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞,每10cm2面积(即3.5cm直径的培养板)加1ml,用移液器吸打几次。TRIzol的用量应根据培养板面积而定,不取决于细胞数。TRIzol加量不足可能导致提取的RNA有DNA污染。
c.细胞悬液 离心收集细胞,每5-10×106动物、植物、酵母细胞或1×107细菌细胞加入1ml TRIzol,反复吸打。加TRIzol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。产品仅用于科研
2.将匀浆样品在室温(15-30℃)放置5分钟,使核酸蛋白复合物完全分离。
3.可选步骤:如样品中含有较多蛋白质,脂肪,多糖或胞外物质(肌肉,植物结节部分等)可于2-8℃10000×g离心10分钟,取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜,多糖,高分子量DNA,上清中含有RNA。处理脂肪组织时,上层有大量油脂应去除。取澄清的匀浆液进行下一步操作。
5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml,剧烈振荡15秒,室温放置3分钟。
6. 2-8℃10000×g离心15分钟。样品分为三层:底层为黄色有机相,上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中,水相体积约为所用TRIzol试剂的60℅。
7. 把水相转移到新管中,如要分离DNA和蛋白质可保留有机相,进一步操作见后。用异丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml异丙醇,室温放置10分钟。
8. 2-8℃10000×g离心10分钟,离心前看不出RNA沉淀,离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。

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