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产品名称:
通用型T载体克隆菌落PCR检测试剂盒
型号:
CS-01F97681
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国产
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产品简介
通用型T载体克隆菌落PCR检测试剂盒现货供应,价格实惠。
产品详情

一、概述:

产品属性: 

产品名称

英文名称

规格

货号

通用型T载体克隆菌落PCR检测试剂盒

Universal T vector colony PCR identification Kit

80|400

CS-01F97681

本试剂盒采用通用T载体引物研制的通用T载体菌落PCR鉴定试剂盒,只需购买一种试剂盒,便可用于市面上所有常见的T载体(包括pGEMpUCpBluescript系列连接阳性克隆的鉴定。此外,采用T3,T7或者SP6做引物的菌落PCR鉴定试剂盒引物距离插入位点的距离非常短,因此在鉴定100bp左右或者更小片段的插入时,阴性克隆的引物二聚体条带和阳性克隆扩增条带大小接近,无法区分。往往把引物二聚体的条带看成是阳性扩增条带,造成假阳性。反之,造成假阴性。本试剂盒通用T载体引物在未插入片段时的距离至少有150bp以上,加上插入片段的长度,可以清晰的区分是插入片段扩增出的条带还是引物二聚体扩增出的条带。避免假阳性或者假阴性,大大提高了准确性。本公司研发的一管便携式PCR MasterMix预混系统,无需您一一加入各种成分,直接加入需筛选单菌落,经过1小时左右的PCR反应和电泳检测即可得到重组菌落鉴定的结果。

试剂盒组份(400)

2 × Taq PCR MasterMix——————5ml

Universal primer F————————250μl

Universal primer R————————250μl

ddH2O———————————————5ml

注意事项:

1. 重组菌落鉴定时,挑取单菌落前,应先做好标记,便于鉴定后使用。

2. 挑取菌落时,应选择单菌落,不要挑取太多菌体,以免影响PCR 结果。

3. 设定PCR 程序时,请根据插入片段大小决定延伸时间,如果插入片段大小为1 kb以下,延伸时间30-45 秒即可,如果片段更长,可按此比例增加延伸时间。
储存条件:-20℃。

实验步骤:
(1)实验开始前将RNA提取液于65℃水浴锅中预热,离心管中加入ME(巯基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)
(2)取约0.8g菌丝体(液体培养获得的菌丝用真空抽滤即可!固体培养就更好说了),在液氮中迅速磨成精细粉末,装入50mL离心管,按1g材料8mL的量加入预热的RNA提取液,颠倒混匀  
(3)65℃水浴3-10 min,期间混匀2-3次
(4)加入等体积的酚(注意是酸酚pH4.5)::异戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(5)取上清,等体积的:异戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(6)加入1/4V体积10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或过夜)
(7)10,000rpm,4℃离心20min
(8)弃上清,用500ul SSTE溶解沉淀
(9)酚::异戊醇(25:24:1)抽提两次,:异戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)
(10)加2V体积的无水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上
(11)12,000rpm,4℃离心20 min
(12)弃上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥
(13)加200ul的DEPC处理水溶解
(14)用非变性琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计扫描检测RNA的质量
(在抽提过程中,若蛋白质含量或其它的杂质还较多,可以增加抽提次数)
操作步骤:
1. 匀浆处理:a.组织 将组织在液氮中磨碎,每50-100mg组织加入1ml TRIzol,用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过TRIzol体积10℅。
b.单层培养细胞 直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞,每10cm2面积(即3.5cm直径的培养板)加1ml,用移液器吸打几次。TRIzol的用量应根据培养板面积而定,不取决于细胞数。TRIzol加量不足可能导致提取的RNA有DNA污染。
c.细胞悬液 离心收集细胞,每5-10×106动物、植物、酵母细胞或1×107细菌细胞加入1ml TRIzol,反复吸打。加TRIzol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。产品仅用于科研
2.将匀浆样品在室温(15-30℃)放置5分钟,使核酸蛋白复合物完全分离。
3.可选步骤:如样品中含有较多蛋白质,脂肪,多糖或胞外物质(肌肉,植物结节部分等)可于2-8℃10000×g离心10分钟,取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜,多糖,高分子量DNA,上清中含有RNA。处理脂肪组织时,上层有大量油脂应去除。取澄清的匀浆液进行下一步操作。
5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml,剧烈振荡15秒,室温放置3分钟。
6. 2-8℃10000×g离心15分钟。样品分为三层:底层为黄色有机相,上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中,水相体积约为所用TRIzol试剂的60℅。
7. 把水相转移到新管中,如要分离DNA和蛋白质可保留有机相,进一步操作见后。用异丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml异丙醇,室温放置10分钟。
8. 2-8℃10000×g离心10分钟,离心前看不出RNA沉淀,离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。

标签:通用型T载体克隆菌落PCR检测试剂盒 80次 400次 

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