产品属性： | 产品名称 | 英文名称 | 规格 | 货号 |
| Simple Cloning T载体(pSC-T) | Simple Cloning T-Vector(pSC-T) | 20次 | CS-01F97650 |
本品是一种PCR产物高效TA克隆的专用T载体，它由pUC18载体改造而成。在PCR克隆构建过程中，为了进一步的克隆步骤，常会在PCR产物的两端引入专门的酶切位点，如T载体上已带有相同的酶切位点，会对下一步的酶切连接带来不利的影响。为消除多克隆酶切位点带来的负作用，Simple Cloning T-vector去除了PCR产物插入区域两侧所有的酶切位点。PCR产物克隆后如果使用其两 端的酶切位点进行酶切时，T载体上不会有相同的酶切位点影响酶切反应，可以大大提高酶切效率，增加亚克隆成功率。多克隆位点的消除并不影响β-半乳糖苷酶的正常表达，PCR产物克隆后仍可以利用α-互补性进行蓝白斑筛选，挑选阳性克隆。由于本载体上消除了多克隆酶切位点，克隆后的PCR产物将无法使用载体上的限制酶切下，需要在PCR扩增引物上导入合适的酶切位点。
| 产品特点： 1、15分钟快速连接： · 随酶提供独特配方的2×快速及10×普通T4 DNA Ligation Buffer。 · 使用2×快速Buffer在室温(25℃)下，仅需15分钟即可完成连接反应。 2、自带快PCR鉴定2×Fast Taq MasterMix及DNA Marker：
2×Fast Taq MasterMix (Quick Load型)已含有PCR反应所需的快速型PCR聚合酶、dNTP混合物、MgCl2、上样染料以及反应缓冲液预先，使用时只需再加入模板和引物并稀释到1倍浓度即可进行PCR反应。其扩增速度为普通Taq酶的数倍，因此可大幅度缩短PCR鉴定过程所需要的时间，自带预混1×Loading Buffer的DNA Ladder 2000 Plus，能满足绝大部分PCR产物电泳的需要。 |
实验步骤：
(1)实验开始前将RNA提取液于65℃水浴锅中预热,离心管中加入ME(巯基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)
(2)取约0.8g菌丝体(液体培养获得的菌丝用真空抽滤即可！固体培养就更好说了),在液氮中迅速磨成精细粉末,装入50mL离心管,按1g材料8mL的量加入预热的RNA提取液,颠倒混匀
(3)65℃水浴3-10 min,期间混匀2-3次
(4)加入等体积的酚(注意是酸酚pH4.5)::异戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(5)取上清,等体积的:异戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(6)加入1/4V体积10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或过夜)
(7)10,000rpm,4℃离心20min
(8)弃上清,用500ul SSTE溶解沉淀
(9)酚::异戊醇(25:24:1)抽提两次,:异戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)
(10)加2V体积的无水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上
(11)12,000rpm,4℃离心20 min
(12)弃上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥
(13)加200ul的DEPC处理水溶解
(14)用非变性琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计扫描检测RNA的质量
(在抽提过程中,若蛋白质含量或其它的杂质还较多,可以增加抽提次数)
操作步骤:
1. 匀浆处理:a.组织 将组织在液氮中磨碎,每50-100mg组织加入1ml TRIzol,用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过TRIzol体积10℅。
b.单层培养细胞 直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞，每10cm2面积(即3.5cm直径的培养板)加1ml，用移液器吸打几次。TRIzol的用量应根据培养板面积而定，不取决于细胞数。TRIzol加量不足可能导致提取的RNA有DNA污染。
c．细胞悬液 离心收集细胞，每5-10×106动物、植物、酵母细胞或1×107细菌细胞加入1ml TRIzol，反复吸打。加TRIzol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。产品仅用于科研
2．将匀浆样品在室温（15-30℃）放置5分钟，使核酸蛋白复合物完全分离。
3．可选步骤：如样品中含有较多蛋白质，脂肪，多糖或胞外物质（肌肉，植物结节部分等）可于2-8℃10000×g离心10分钟，取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。处理脂肪组织时，上层有大量油脂应去除。取澄清的匀浆液进行下一步操作。
5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，剧烈振荡15秒，室温放置3分钟。
6. 2-8℃10000×g离心15分钟。样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIzol试剂的60℅。
7. 把水相转移到新管中，如要分离DNA和蛋白质可保留有机相，进一步操作见后。用异丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml异丙醇，室温放置10分钟。
8. 2-8℃10000×g离心10分钟，离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。
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