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分子生物学试剂 > 克隆与表达 > 质粒大量抽提试剂盒(100mL)
产品名称:
质粒大量抽提试剂盒(100mL)
型号:
CS-01F97621
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质粒大量抽提试剂盒(100mL)现货供应,价格实惠。
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一、概述:

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质粒大量抽提试剂盒(100mL)

Plasmid Maxi Preparation Kit(100mL)

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CS-01F97621

本试剂盒是一种用于从大肠杆菌中进行大量质粒快速抽提的离心柱式试剂盒。本试剂盒抽提得到的质粒可直接用于转染细胞,DNA测序,PCR,基于PCR的突变,体外转录,转化细菌,内切酶消化等。

本试剂盒适用于常用的EndA-菌株DH5AJM109XL-1 blue等。对于EndA+菌株如JM110BL21 (DE3)TG1HB101

等,可以顺利完成质粒抽提,但从EndA+菌株中抽提获得的质粒会有轻微的核酸酶污染,如果在内切酶缓冲液中37℃孵育1小时会导致质粒全部降解。从EndA+菌株中抽提质粒时推荐使用我公司的通用型质粒小量抽提试剂盒(YTB4001)、通用型质粒中量抽提试剂盒(YTB4002)和通用型质粒大量抽提试剂盒(YTB4003)

野生型大肠杆菌中表达Endonuclease I,能切割并降解双链DNA。编码Endonuclease I的基因是endA,如果endA突变失活,其基因型会被标注为endA1,相应的突变菌株被称为EndA-菌株,而野生型菌株则被称为EndA+菌株。常见的EndA-EndA+菌株参见附表1。从EndA+菌株中抽提的质粒,微量核酸酶和质粒结合而容易被共纯化,导致容易降解。

本试剂盒采用了一种新型的离子交换柱。在特定条件下,使质粒能在离心过柱的瞬间,结合到质粒纯化柱上,在一定条件下又能将质粒充分洗脱,从而实现质粒的快速纯化。无需酚氯仿抽提,无需酒精沉淀,6个样品只需不足90分钟即可完成。

每个质粒纯化柱可以结合的质粒量的上限大于500μg。每个纯化柱可用于抽提100mL左右用LB培养过夜的大肠杆菌。抽提所得质粒的OD260OD280比值一般在1.80左右。抽提获得的质粒量会受质粒拷贝数等因素影响。抽提获得的质粒DNAOD260OD280比值也会因菌种不同等原因而略有波动。
保存条件:室温保存,一年有效。

实验步骤:
(1)实验开始前将RNA提取液于65℃水浴锅中预热,离心管中加入ME(巯基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)
(2)取约0.8g菌丝体(液体培养获得的菌丝用真空抽滤即可!固体培养就更好说了),在液氮中迅速磨成精细粉末,装入50mL离心管,按1g材料8mL的量加入预热的RNA提取液,颠倒混匀  
(3)65℃水浴3-10 min,期间混匀2-3次
(4)加入等体积的酚(注意是酸酚pH4.5)::异戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(5)取上清,等体积的:异戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(6)加入1/4V体积10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或过夜)
(7)10,000rpm,4℃离心20min
(8)弃上清,用500ul SSTE溶解沉淀
(9)酚::异戊醇(25:24:1)抽提两次,:异戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)
(10)加2V体积的无水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上
(11)12,000rpm,4℃离心20 min
(12)弃上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥
(13)加200ul的DEPC处理水溶解
(14)用非变性琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计扫描检测RNA的质量
(在抽提过程中,若蛋白质含量或其它的杂质还较多,可以增加抽提次数)
操作步骤:
1. 匀浆处理:a.组织 将组织在液氮中磨碎,每50-100mg组织加入1ml TRIzol,用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过TRIzol体积10℅。
b.单层培养细胞 直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞,每10cm2面积(即3.5cm直径的培养板)加1ml,用移液器吸打几次。TRIzol的用量应根据培养板面积而定,不取决于细胞数。TRIzol加量不足可能导致提取的RNA有DNA污染。
c.细胞悬液 离心收集细胞,每5-10×106动物、植物、酵母细胞或1×107细菌细胞加入1ml TRIzol,反复吸打。加TRIzol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。产品仅用于科研
2.将匀浆样品在室温(15-30℃)放置5分钟,使核酸蛋白复合物完全分离。
3.可选步骤:如样品中含有较多蛋白质,脂肪,多糖或胞外物质(肌肉,植物结节部分等)可于2-8℃10000×g离心10分钟,取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜,多糖,高分子量DNA,上清中含有RNA。处理脂肪组织时,上层有大量油脂应去除。取澄清的匀浆液进行下一步操作。
5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml,剧烈振荡15秒,室温放置3分钟。
6. 2-8℃10000×g离心15分钟。样品分为三层:底层为黄色有机相,上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中,水相体积约为所用TRIzol试剂的60℅。
7. 把水相转移到新管中,如要分离DNA和蛋白质可保留有机相,进一步操作见后。用异丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml异丙醇,室温放置10分钟。
8. 2-8℃10000×g离心10分钟,离心前看不出RNA沉淀,离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。

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