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产品名称:
裂殖酵母化学感受态细胞制备试剂盒
型号:
CS-01F97562
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产品简介
裂殖酵母化学感受态细胞制备试剂盒现货供应,价格实惠。
产品详情

一、概述:

产品属性: 

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裂殖酵母化学感受态细胞制备试剂盒

S.pombe Chemical Competent Cell Preparation Kit

20

CS-01F97562

 本裂殖酵母化学感受态细胞制备试剂是一种通过化学处理,高效快速制备裂殖酵母化学感受态细胞,用于长期冻存以备后续转化的产品。

产品特点:

1.一次制备,-80℃保存,多次使用,免去每次转化都要制备裂殖酵母感受态细胞。

2.操作简单,单溶液制备,除酵母培养的时间外,整个操作只需要30分钟。

3.主要用于裂殖酵母S.pombe,其他多种实验用酵母菌株好选用酵母化学感受态细胞制备试剂(BTN81109)

4.受体酵母可以不含质粒,也可用于携带有选择性质粒的酵母(如双杂交体系中的酵母)

5.高转化效率可达到0.2-1×105个转化子/μg质粒DNA

6.得到的感受态细胞可以用各种线性或环状酵母穿梭质粒DNA进行转化,例如YIpYRpYCpYEpYAC等。

7.可以用于酵母双杂交、定点突变、基因破坏、等位突变基因修复等实验。

8.本产品可以制备20只裂殖酵母感受态细胞(需要100mL裂殖酵母培养液),其中A型只用于制备感受态细胞,B型还带高效转化液。

储存条件:常温运输及保存,有效期一年。

使用效果:
将一个酵母菌落接种到SLD培养基中,30℃摇晃培养直到OD600达到0.6-1.0,冰浴15分钟后离心弃上清,用自备无菌水洗涤三次,然后用相当于菌液初体积百分之一的溶液A重悬,按每管50μl分装,放-80℃保存。

实验步骤:
(1)实验开始前将RNA提取液于65℃水浴锅中预热,离心管中加入ME(巯基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)
(2)取约0.8g菌丝体(液体培养获得的菌丝用真空抽滤即可!固体培养就更好说了),在液氮中迅速磨成精细粉末,装入50mL离心管,按1g材料8mL的量加入预热的RNA提取液,颠倒混匀  
(3)65℃水浴3-10 min,期间混匀2-3次
(4)加入等体积的酚(注意是酸酚pH4.5)::异戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(5)取上清,等体积的:异戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(6)加入1/4V体积10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或过夜)
(7)10,000rpm,4℃离心20min
(8)弃上清,用500ul SSTE溶解沉淀
(9)酚::异戊醇(25:24:1)抽提两次,:异戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)
(10)加2V体积的无水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上
(11)12,000rpm,4℃离心20 min
(12)弃上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥
(13)加200ul的DEPC处理水溶解
(14)用非变性琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计扫描检测RNA的质量
(在抽提过程中,若蛋白质含量或其它的杂质还较多,可以增加抽提次数)
操作步骤:
1. 匀浆处理:a.组织 将组织在液氮中磨碎,每50-100mg组织加入1ml TRIzol,用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过TRIzol体积10℅。
b.单层培养细胞 直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞,每10cm2面积(即3.5cm直径的培养板)加1ml,用移液器吸打几次。TRIzol的用量应根据培养板面积而定,不取决于细胞数。TRIzol加量不足可能导致提取的RNA有DNA污染。
c.细胞悬液 离心收集细胞,每5-10×106动物、植物、酵母细胞或1×107细菌细胞加入1ml TRIzol,反复吸打。加TRIzol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。产品仅用于科研
2.将匀浆样品在室温(15-30℃)放置5分钟,使核酸蛋白复合物完全分离。
3.可选步骤:如样品中含有较多蛋白质,脂肪,多糖或胞外物质(肌肉,植物结节部分等)可于2-8℃10000×g离心10分钟,取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜,多糖,高分子量DNA,上清中含有RNA。处理脂肪组织时,上层有大量油脂应去除。取澄清的匀浆液进行下一步操作。
5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml,剧烈振荡15秒,室温放置3分钟。
6. 2-8℃10000×g离心15分钟。样品分为三层:底层为黄色有机相,上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中,水相体积约为所用TRIzol试剂的60℅。
7. 把水相转移到新管中,如要分离DNA和蛋白质可保留有机相,进一步操作见后。用异丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml异丙醇,室温放置10分钟。
8. 2-8℃10000×g离心10分钟,离心前看不出RNA沉淀,离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。

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