全血PCR增强液CS-01F97527_上海莼试生物技术有限公司

产品详情

一、概述：

产品属性：

产品名称	英文名称	规格	货号
全血PCR增强液	2×Blood PCR Enhancer	20μL×200T\|20μL×1000T	CS-01F97527

本制品是一种使用的BloodTaq DNA Polymerase (Blood-resistant，货号：YTB4081)或BloodTaq HF DNA Polymerase (Blood-resistant，货号：YTB4082)时，克服因模板高GC含量所导致的PCR扩增障碍的PCR增剂。高GC含量DNA片段的扩增一直是分子生物学操作过程中的一个难点，本产品可用于含有肝素、柠檬酸钠以及EDTA等抗凝血的直接PCR反应，从而大大提高了高GC含量DNA模板的扩增效率及扩增的特异性。本产品也可以用于普通PCR时扩增高GC含量的目的片段。

2×Blood PCR Enhancer可以适用于商业化的常见的多种耐血DNA聚合酶，如的BloodTaq DNA Polymerase (Blood-resistant，货号：YTB4081)和BloodTaq HF DNA Polymerase (Blood-resistant，货号：YTB4082)，NEB的Hemo KlenTaq等。

保存：-20℃

注意事项：

在使用本产品2×Blood PCR Enhancer的同时，必须同时使用和耐血DNA聚合酶配套的终浓度为1×的PCR Buffer。

本产品溶解时如果有结晶状沉淀物，可以在50℃水浴温育片刻促进溶解，并确保完全溶解后使用。

请尽量使用新近采集的抗凝血样本进行检测；如果是冻存的样本，尽量避免反复冻融，以免在冻融过程中导致目的基因的断裂和降解。

设置PCR反应体系时，抗凝血的推荐用量为PCR体系总体积的5～10%左右，可以直接添加到PCR体系中，无需进行任何额外处理。

PCR反应结束之后，建议3000～5000g离心3～5min以沉淀血细胞碎片，便于吸取上清用于电泳分析等。

注意：由于抗凝血本身的原因，PCR结束后在PCR管底部会出现透明凝胶状物质，此为正常现象。
由于PCR反应非常灵敏，可以扩增目的基因序列过1000万倍，在操作时请注意避免微量待扩增DNA的污染，并尽量考虑设置不加模板的空白对照以确认是否有待扩增DNA的污染。

实验步骤：

(1)实验开始前将RNA提取液于65℃水浴锅中预热,离心管中加入ME(巯基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取约0.8g菌丝体(液体培养获得的菌丝用真空抽滤即可！固体培养就更好说了),在液氮中迅速磨成精细粉末,装入50mL离心管,按1g材料8mL的量加入预热的RNA提取液,颠倒混匀

(3)65℃水浴3-10 min,期间混匀2-3次

(4)加入等体积的酚(注意是酸酚pH4.5)::异戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等体积的:异戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V体积10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或过夜)

(7)10,000rpm,4℃离心20min

(8)弃上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::异戊醇(25:24:1)抽提两次,:异戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V体积的无水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃离心20 min

(12)弃上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC处理水溶解

(14)用非变性琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计扫描检测RNA的质量

(在抽提过程中,若蛋白质含量或其它的杂质还较多,可以增加抽提次数)

操作步骤:

1. 匀浆处理:a.组织将组织在液氮中磨碎,每50-100mg组织加入1ml TRIzol,用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过TRIzol体积10℅。

b.单层培养细胞直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞，每10cm2面积(即3.5cm直径的培养板)加1ml，用移液器吸打几次。TRIzol的用量应根据培养板面积而定，不取决于细胞数。TRIzol加量不足可能导致提取的RNA有DNA污染。

c．细胞悬液离心收集细胞，每5-10×106动物、植物、酵母细胞或1×107细菌细胞加入1ml TRIzol，反复吸打。加TRIzol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。产品仅用于科研

2．将匀浆样品在室温（15-30℃）放置5分钟，使核酸蛋白复合物完全分离。

3．可选步骤：如样品中含有较多蛋白质，脂肪，多糖或胞外物质（肌肉，植物结节部分等）可于2-8℃10000×g离心10分钟，取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。处理脂肪组织时，上层有大量油脂应去除。取澄清的匀浆液进行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，剧烈振荡15秒，室温放置3分钟。

6. 2-8℃10000×g离心15分钟。样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIzol试剂的60℅。

7. 把水相转移到新管中，如要分离DNA和蛋白质可保留有机相，进一步操作见后。用异丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml异丙醇，室温放置10分钟。

8. 2-8℃10000×g离心10分钟，离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。

标签：全血PCR增强液 20μL×200T 20μL×1000T

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