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产品名称:
荧光定量PCR反应预混液(SYBR Green I)
型号:
CS-01F97493
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产品简介
荧光定量PCR反应预混液(SYBR Green I)现货供应,价格实惠。
产品详情

一、概述:

产品属性: 

产品名称

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规格

货号

荧光定量PCR反应预混液(SYBR Green I)

2×ByFast SYBR Green qPCR Mix

1mL|5×1mL|25×1mL

CS-01F97493

本制品是一种用于实时荧光定量PCR,即qPCR(Quantitative PCR)real-time PCR的高品质预混液,主要用于cDNA和基因组DNA等的特异性高灵敏度定量检测。

本制品使用SYBR Green I作为染料。SYBR Green I是一种结合于双链DNA(dsDNA)双螺旋小沟区域的绿色荧光染料。SYBR Green I在游离状态下的荧光比较微弱,一旦与双链DNA结合后,其荧光会大大增。这样通过检测荧光弱就可以定量检测PCR过程中扩增产生的双链DNA的数量。

本制品使用的ByFast Taq DNA Polymerase是一种与抗体结合的高品质热启动酶,能够实现便捷高效的热启动。ByFast Taq DNA Polymerase中的Taq酶与抗Taq酶的单克隆抗体相互结合,从而抑制了Taq酶的DNA聚合酶活性,这样可以有效避免在低温条件下由引物和模板DNA非特异性退火或引物二聚体引起的非特异性扩增。在PCR反应的预变性步骤中抗体会被加热失活,这样可以确保仅在预变性后才会把Taq酶的活性释放出来,预变性之前不会发生DNA聚合反应,从而大大提高了PCR反应的特异性、灵敏度和定量检测的准确性。

本制品包含了ByFast Taq DNA PolymerasePCR BufferdNTPsSYBR Green I荧光染料、稳定剂和镁离子等所有的通用组分,使操作更简单、使用更便捷。用户只需自备引物、样品DNA和去离子水即可。

保存:-20℃避光保存,一年有效;4℃避光保存,一个月内有效。尽量避免反复冻融。

规格说明:

本制品如果用于常规的96孔板qPCR检测(建议反应体系为20μL),每mL本产品可以进行100次检测;如果用于常规的384孔板qPCR检测(建议反应体系为10μL),每mL本产品可以进行200次检测。

注意事项:

使用前需确保整管试剂完全融化,上下颠倒轻轻混匀后使用。混匀过程中尽量避免产生气泡。

注意引物退火温度,当退火温度<60℃时,推荐使用三步法PCR扩增。

本制品中含有SYBR Green I荧光染料,保存本产品或设置PCR反应时应避免光照射,以尽量避免荧光淬灭问题。

对于过350bp或者高GC含量的扩增片段,建议增加延伸时间至60秒或者采用三步法以提高扩增效率。

经测试,本制品反复冻融10次对使用效果无显著影响。但仍需尽量避免反复冻融本产品,反复冻融可能使产品性能下降。
qPCR检测是高灵敏度的检测,PCR反应设置区域需尽量避免各种可能的待扩增产物的污染。PCR产物宜密封后丢弃,以避免高浓度的PCR产物污染实验环境。

实验步骤:
(1)实验开始前将RNA提取液于65℃水浴锅中预热,离心管中加入ME(巯基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)
(2)取约0.8g菌丝体(液体培养获得的菌丝用真空抽滤即可!固体培养就更好说了),在液氮中迅速磨成精细粉末,装入50mL离心管,按1g材料8mL的量加入预热的RNA提取液,颠倒混匀  
(3)65℃水浴3-10 min,期间混匀2-3次
(4)加入等体积的酚(注意是酸酚pH4.5)::异戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(5)取上清,等体积的:异戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(6)加入1/4V体积10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或过夜)
(7)10,000rpm,4℃离心20min
(8)弃上清,用500ul SSTE溶解沉淀
(9)酚::异戊醇(25:24:1)抽提两次,:异戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)
(10)加2V体积的无水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上
(11)12,000rpm,4℃离心20 min
(12)弃上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥
(13)加200ul的DEPC处理水溶解
(14)用非变性琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计扫描检测RNA的质量
(在抽提过程中,若蛋白质含量或其它的杂质还较多,可以增加抽提次数)
操作步骤:
1. 匀浆处理:a.组织 将组织在液氮中磨碎,每50-100mg组织加入1ml TRIzol,用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过TRIzol体积10℅。
b.单层培养细胞 直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞,每10cm2面积(即3.5cm直径的培养板)加1ml,用移液器吸打几次。TRIzol的用量应根据培养板面积而定,不取决于细胞数。TRIzol加量不足可能导致提取的RNA有DNA污染。
c.细胞悬液 离心收集细胞,每5-10×106动物、植物、酵母细胞或1×107细菌细胞加入1ml TRIzol,反复吸打。加TRIzol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。产品仅用于科研
2.将匀浆样品在室温(15-30℃)放置5分钟,使核酸蛋白复合物完全分离。
3.可选步骤:如样品中含有较多蛋白质,脂肪,多糖或胞外物质(肌肉,植物结节部分等)可于2-8℃10000×g离心10分钟,取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜,多糖,高分子量DNA,上清中含有RNA。处理脂肪组织时,上层有大量油脂应去除。取澄清的匀浆液进行下一步操作。
5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml,剧烈振荡15秒,室温放置3分钟。
6. 2-8℃10000×g离心15分钟。样品分为三层:底层为黄色有机相,上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中,水相体积约为所用TRIzol试剂的60℅。
7. 把水相转移到新管中,如要分离DNA和蛋白质可保留有机相,进一步操作见后。用异丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml异丙醇,室温放置10分钟。
8. 2-8℃10000×g离心10分钟,离心前看不出RNA沉淀,离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。

标签:荧光定量PCR反应预混液(SYBR Green I) 1mL 5×1mL 

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