产品属性： | 产品名称 | 英文名称 | 规格 | 货号 |
| 一步免提取RT-PCR试剂盒(探针法) | Sample Direct RT-qPCR Kit | 25μl×200次|25μl×1000次 | CS-01F97488 |
本制品是采用探针法进行One-Step Real-Time RT-qPCR的专用试剂盒。使用时只需要加入检测目的基因所需的引物、探针及模板样品，即可快速开始反应。样品数量较多时，本制品可以直接以含有RNA病毒等的生物样品起始反应，无需进行RNA提取及纯化。由于核酸提取、反转录、qPCR各反应在同一反应管中连续进行，大大提高了操作简便性，减少了反应时间。从核酸提取（90℃）到反转录反应（55-65℃）连续进行，对于含有复杂高级结构的RNA病毒等的检测也能发挥作用。cDNA合成后进行高扩增效率的PCR反应，探针发出的荧光可实时检出。
| 对于重复检测特定目的基因等的实验，实验环境中常混有先前检测反应的扩增产物，本制品中含有能够分解带有dUTP的PCR产物的UNG酶（Uracil N-Glycosylase），持续使用本制品能够有效避免交叉污染造成的假阳性问题。 本制品对于肝素（血液）和腐殖酸（土壤）等各种阻害物质具有高耐受性，可用于从各种生物样品直接起始进行病毒及细菌检测，或基因的表达分析等应用。 保存条件：-20℃ 工作原理： 1．RT-PCR
RNA虽不能直接作为PCR的模板，但是通过使用反转录酶将RNA合成cDNA，就可以利用PCR对RNA进行分析。这就是RT-PCR，是高灵敏度的RNA检测方法。本制品使用One Step RT-PCR法，其原理如下图所示。One Step RT-PCR先使用PCR用特异性引物（Reverse）进行反转录反应，然后以合成的cDNA为模板，经特异性引物（Forward,Reverse）进行PCR扩增，整个反应在同一个反应管中连续进行。 |
实验步骤：
(1)实验开始前将RNA提取液于65℃水浴锅中预热,离心管中加入ME(巯基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)
(2)取约0.8g菌丝体(液体培养获得的菌丝用真空抽滤即可！固体培养就更好说了),在液氮中迅速磨成精细粉末,装入50mL离心管,按1g材料8mL的量加入预热的RNA提取液,颠倒混匀
(3)65℃水浴3-10 min,期间混匀2-3次
(4)加入等体积的酚(注意是酸酚pH4.5)::异戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(5)取上清,等体积的:异戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(6)加入1/4V体积10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或过夜)
(7)10,000rpm,4℃离心20min
(8)弃上清,用500ul SSTE溶解沉淀
(9)酚::异戊醇(25:24:1)抽提两次,:异戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)
(10)加2V体积的无水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上
(11)12,000rpm,4℃离心20 min
(12)弃上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥
(13)加200ul的DEPC处理水溶解
(14)用非变性琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计扫描检测RNA的质量
(在抽提过程中,若蛋白质含量或其它的杂质还较多,可以增加抽提次数)
操作步骤:
1. 匀浆处理:a.组织 将组织在液氮中磨碎,每50-100mg组织加入1ml TRIzol,用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过TRIzol体积10℅。
b.单层培养细胞 直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞，每10cm2面积(即3.5cm直径的培养板)加1ml，用移液器吸打几次。TRIzol的用量应根据培养板面积而定，不取决于细胞数。TRIzol加量不足可能导致提取的RNA有DNA污染。
c．细胞悬液 离心收集细胞，每5-10×106动物、植物、酵母细胞或1×107细菌细胞加入1ml TRIzol，反复吸打。加TRIzol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。产品仅用于科研
2．将匀浆样品在室温（15-30℃）放置5分钟，使核酸蛋白复合物完全分离。
3．可选步骤：如样品中含有较多蛋白质，脂肪，多糖或胞外物质（肌肉，植物结节部分等）可于2-8℃10000×g离心10分钟，取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。处理脂肪组织时，上层有大量油脂应去除。取澄清的匀浆液进行下一步操作。
5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，剧烈振荡15秒，室温放置3分钟。
6. 2-8℃10000×g离心15分钟。样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIzol试剂的60℅。
7. 把水相转移到新管中，如要分离DNA和蛋白质可保留有机相，进一步操作见后。用异丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml异丙醇，室温放置10分钟。
8. 2-8℃10000×g离心10分钟，离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。
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