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分子生物学试剂 > 核酸扩增 > SYBR Green I(PCR级,10000X)
产品名称:
SYBR Green I(PCR级,10000X)
型号:
CS-01F97280
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产品简介
SYBR Green I(PCR级,10000X)现货供应,价格实惠。
产品详情

一、概述:

产品属性: 

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SYBR Green I(PCR级,10000X)

SYBR Green I(PCR级,10000X) 

50μl|100μl|1ml

CS-01F97280

SYBR Green I 染料是一种直接与双链 DNA (dsDNA) 结合的荧光染料,是荧光定量PCR 常用的DNA结合染料。在定量 PCR中,SYBR Green I可与双链DNA(dsDNA)非特异性结合后发出荧光,则可以通过检测反应体系中的SYBR Green I 荧光度,达到检测PCR 产物扩增量的目的。游离状态下,SYBR Green I发出微弱的荧光,一旦与dsDNA结合,其荧光增加1000倍,一个反应发出的全部荧光信号与出现的dsDNA量成比例,且会随扩增产物的增加而增加;所以通过检测PCR 反应液中的荧光信号度,可以对目的基因进行准确定量,同时还可以测定扩增的目的DNA片段的熔解温度。

使用说明:

使用时,配置PCR反应混合液,将10000×SYBR Green I浓缩液加入到PCR反应体系,使终浓度为0.5× (0.2×到1×之间调整)。以上操作建议在冰上进行。

注:

反应液配制方法和PCR 扩增条件请参照DNA聚合酶使用说明。

Realtime PCR 扩增仪的使用方法,请参照各仪器说明书。

注意事项:

使用浓度对荧光PCR结果的影响

SYBR Green I的使用浓度是保证荧光定量PCR实验成功非常关键的因素。如果SYBR Green I的浓度过低会使荧光信号的变化降低,这就意味着低拷贝的样品可能无法检出;而在高浓度时,将会抑制PCR反应,降低PCR反应效率。所以一般在使用SYBR Green I时应根据实际情况优化使用浓度,反应的终浓度为0.2×到1×之间。

镁离子浓度的影响

提高镁离子浓度可以降低SYBR Green IPCR反应的抑制作用。我们建议在用SYBR Green I进行荧光PCR反应时,镁离子浓度比无SYBR Green I 的普通 PCR 反应高出0.53mM储存条件:-20℃避光,有效期至少一年。

实验步骤:
(1)实验开始前将RNA提取液于65℃水浴锅中预热,离心管中加入ME(巯基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)
(2)取约0.8g菌丝体(液体培养获得的菌丝用真空抽滤即可!固体培养就更好说了),在液氮中迅速磨成精细粉末,装入50mL离心管,按1g材料8mL的量加入预热的RNA提取液,颠倒混匀  
(3)65℃水浴3-10 min,期间混匀2-3次
(4)加入等体积的酚(注意是酸酚pH4.5)::异戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(5)取上清,等体积的:异戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(6)加入1/4V体积10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或过夜)
(7)10,000rpm,4℃离心20min
(8)弃上清,用500ul SSTE溶解沉淀
(9)酚::异戊醇(25:24:1)抽提两次,:异戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)
(10)加2V体积的无水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上
(11)12,000rpm,4℃离心20 min
(12)弃上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥
(13)加200ul的DEPC处理水溶解
(14)用非变性琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计扫描检测RNA的质量
(在抽提过程中,若蛋白质含量或其它的杂质还较多,可以增加抽提次数)
操作步骤:
1. 匀浆处理:a.组织 将组织在液氮中磨碎,每50-100mg组织加入1ml TRIzol,用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过TRIzol体积10℅。
b.单层培养细胞 直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞,每10cm2面积(即3.5cm直径的培养板)加1ml,用移液器吸打几次。TRIzol的用量应根据培养板面积而定,不取决于细胞数。TRIzol加量不足可能导致提取的RNA有DNA污染。
c.细胞悬液 离心收集细胞,每5-10×106动物、植物、酵母细胞或1×107细菌细胞加入1ml TRIzol,反复吸打。加TRIzol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。产品仅用于科研
2.将匀浆样品在室温(15-30℃)放置5分钟,使核酸蛋白复合物完全分离。
3.可选步骤:如样品中含有较多蛋白质,脂肪,多糖或胞外物质(肌肉,植物结节部分等)可于2-8℃10000×g离心10分钟,取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜,多糖,高分子量DNA,上清中含有RNA。处理脂肪组织时,上层有大量油脂应去除。取澄清的匀浆液进行下一步操作。
5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml,剧烈振荡15秒,室温放置3分钟。
6. 2-8℃10000×g离心15分钟。样品分为三层:底层为黄色有机相,上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中,水相体积约为所用TRIzol试剂的60℅。
7. 把水相转移到新管中,如要分离DNA和蛋白质可保留有机相,进一步操作见后。用异丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml异丙醇,室温放置10分钟。
8. 2-8℃10000×g离心10分钟,离心前看不出RNA沉淀,离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。

标签:SYBR Green I(PCR级 10000X) 50μl 

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