产品属性： | 产品名称 | 英文名称 | 规格 | 货号 |
| Direct One Tube RT-PCR试剂盒 | | 100次|500次 | CS-01F97258 |
介绍
One-Tube RT-PCR(一管式RT-PCR)区别于传统的两步法（逆转录和PCR扩增分两步完成），RNA模板逆转录和cDNA扩增在一个管内完成，大大降低了污染的风险、缩短了分析时间并且提高了反应的重复性。One-Tube RT-PCR采用优化的缓冲液体系，高纯度酶，无DNA、RNA残留，逆转录酶选用高活性M-MLV 逆转录酶（RNase H-），PCR扩增选用热启动高保真KOD酶，明显减少错配。
| RT-PCR的产物可以通过琼脂糖凝胶电泳和EB染色进行分析，及下游的常规操作，如：限制性内切酶酶切、连接、DNA测序、dHPLC分析；或采用定量PCR仪进行qRT-PCR进行在线分析。 产品应用： cDNA克隆（平末端连接、限制性酶切、琼脂糖凝胶电泳/EB染色、荧光毛细管电泳、DNA测序等）； 特别适合RNA的qRT-PCR分析； RNA病毒或者RNA样品的定量或半定量分析。 产品优势： （1）无需分管，简单方便、降低污染风险、缩短分析时间； （2）反应所需的酶及其他出buffer以外的试剂为预混Mix，保证用量的准确性、方便操作； （3）高活性和高稳定性的逆转录酶和DNA聚合酶，保证反应的高灵敏度和高特异性； （4）DNA聚合酶选用热启动KOD，保真性比Taq酶高20倍以上（产物适合平末端连接）； （5）特别适合RNA样品的定量或半定量分析。
保存条件：One-Tube RT-PCR kits可在-20℃下保存，有效期1年以上。 |
实验步骤：
(1)实验开始前将RNA提取液于65℃水浴锅中预热,离心管中加入ME(巯基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)
(2)取约0.8g菌丝体(液体培养获得的菌丝用真空抽滤即可！固体培养就更好说了),在液氮中迅速磨成精细粉末,装入50mL离心管,按1g材料8mL的量加入预热的RNA提取液,颠倒混匀
(3)65℃水浴3-10 min,期间混匀2-3次
(4)加入等体积的酚(注意是酸酚pH4.5)::异戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(5)取上清,等体积的:异戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(6)加入1/4V体积10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或过夜)
(7)10,000rpm,4℃离心20min
(8)弃上清,用500ul SSTE溶解沉淀
(9)酚::异戊醇(25:24:1)抽提两次,:异戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)
(10)加2V体积的无水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上
(11)12,000rpm,4℃离心20 min
(12)弃上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥
(13)加200ul的DEPC处理水溶解
(14)用非变性琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计扫描检测RNA的质量
(在抽提过程中,若蛋白质含量或其它的杂质还较多,可以增加抽提次数)
操作步骤:
1. 匀浆处理:a.组织 将组织在液氮中磨碎,每50-100mg组织加入1ml TRIzol,用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过TRIzol体积10℅。
b.单层培养细胞 直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞，每10cm2面积(即3.5cm直径的培养板)加1ml，用移液器吸打几次。TRIzol的用量应根据培养板面积而定，不取决于细胞数。TRIzol加量不足可能导致提取的RNA有DNA污染。
c．细胞悬液 离心收集细胞，每5-10×106动物、植物、酵母细胞或1×107细菌细胞加入1ml TRIzol，反复吸打。加TRIzol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。产品仅用于科研
2．将匀浆样品在室温（15-30℃）放置5分钟，使核酸蛋白复合物完全分离。
3．可选步骤：如样品中含有较多蛋白质，脂肪，多糖或胞外物质（肌肉，植物结节部分等）可于2-8℃10000×g离心10分钟，取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。处理脂肪组织时，上层有大量油脂应去除。取澄清的匀浆液进行下一步操作。
5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，剧烈振荡15秒，室温放置3分钟。
6. 2-8℃10000×g离心15分钟。样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIzol试剂的60℅。
7. 把水相转移到新管中，如要分离DNA和蛋白质可保留有机相，进一步操作见后。用异丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml异丙醇，室温放置10分钟。
8. 2-8℃10000×g离心10分钟，离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。
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