产品属性： | 产品名称 | 英文名称 | 规格 | 货号 |
| 热启动Taq DNA聚合酶Plus | HotStart Taq Plus DNA Polymerase | 250U|250U×5 | CS-01F97255 |
介绍
本制品是Taq Plus经特殊工艺处理后的制品。经处理后的Taq Plus酶在热激活前，其聚合酶活性被抑制，从而抑制低温条件下由引物的非特异性退火或引物二聚体引起的非特异性扩增。本制品适用于高特异性PCR反应、Multiplex PCR、高GC含量（>60%），有二级结构等有较背景的基因组扩增的扩增和大规模基因组扩增检测。与HotStart Taq DNA聚合酶（JN0023）相比，具有扩增长度增加（简单模板可有效扩增20kb，复杂模板可有效扩增10kb)，保真度好的特点。
产品组成：
组份 JN0024-250U
HotStart Taq Plus（5U/μl） 50μl
dNTP混合液(各10mM) 200μl
5×HotStart Taq Plus Buffer with Mg2+ 2ml
| 产品特点： 1、简便：与常规热启动酶反应条件一致，无需改变PCR程序设置（图例一）。 2、高效：有效减少了杂带及拖带产生，从而实现高特异性的PCR。 3、灵敏：可从0.05ng人基因组DNA模板中扩增出特定基因片段。 产品用途： 1、高特异性PCR反应； 2、复杂模板扩增； 3、Multiplex PCR； 4、基因组扩增检测； 5、大片段PCR扩增反应(可达20 kb)。
使用建议：使用本试剂扩增得到的PCR产物3′端有一突出"A"碱基，可直接克隆于T载体中。 |
实验步骤：
(1)实验开始前将RNA提取液于65℃水浴锅中预热,离心管中加入ME(巯基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)
(2)取约0.8g菌丝体(液体培养获得的菌丝用真空抽滤即可！固体培养就更好说了),在液氮中迅速磨成精细粉末,装入50mL离心管,按1g材料8mL的量加入预热的RNA提取液,颠倒混匀
(3)65℃水浴3-10 min,期间混匀2-3次
(4)加入等体积的酚(注意是酸酚pH4.5)::异戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(5)取上清,等体积的:异戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(6)加入1/4V体积10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或过夜)
(7)10,000rpm,4℃离心20min
(8)弃上清,用500ul SSTE溶解沉淀
(9)酚::异戊醇(25:24:1)抽提两次,:异戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)
(10)加2V体积的无水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上
(11)12,000rpm,4℃离心20 min
(12)弃上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥
(13)加200ul的DEPC处理水溶解
(14)用非变性琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计扫描检测RNA的质量
(在抽提过程中,若蛋白质含量或其它的杂质还较多,可以增加抽提次数)
操作步骤:
1. 匀浆处理:a.组织 将组织在液氮中磨碎,每50-100mg组织加入1ml TRIzol,用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过TRIzol体积10℅。
b.单层培养细胞 直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞，每10cm2面积(即3.5cm直径的培养板)加1ml，用移液器吸打几次。TRIzol的用量应根据培养板面积而定，不取决于细胞数。TRIzol加量不足可能导致提取的RNA有DNA污染。
c．细胞悬液 离心收集细胞，每5-10×106动物、植物、酵母细胞或1×107细菌细胞加入1ml TRIzol，反复吸打。加TRIzol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。产品仅用于科研
2．将匀浆样品在室温（15-30℃）放置5分钟，使核酸蛋白复合物完全分离。
3．可选步骤：如样品中含有较多蛋白质，脂肪，多糖或胞外物质（肌肉，植物结节部分等）可于2-8℃10000×g离心10分钟，取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。处理脂肪组织时，上层有大量油脂应去除。取澄清的匀浆液进行下一步操作。
5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，剧烈振荡15秒，室温放置3分钟。
6. 2-8℃10000×g离心15分钟。样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIzol试剂的60℅。
7. 把水相转移到新管中，如要分离DNA和蛋白质可保留有机相，进一步操作见后。用异丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml异丙醇，室温放置10分钟。
8. 2-8℃10000×g离心10分钟，离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。
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