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产品名称:
PCR产物纯化回收试剂盒(测序级)
型号:
CS-01F97239
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PCR产物纯化回收试剂盒(测序级)现货供应,价格实惠。
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一、概述:

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PCR产物纯化回收试剂盒(测序级)

 

100

CS-01F97239

本试剂盒利用核酸外切酶I和热敏碱性磷酸酶,仅需简单的保温步骤,方便地去除多余的引物和dNTPs,净化的PCR产物可直接用于测序反应,且不会

损失任何产物。此法可以避免繁琐的胶回收、柱纯化、沉淀、磁珠、过滤、透析等方法,大大节省实验费用及时间。适用于大规模PCR产物净化测序,大幅提高实

操作步骤:

1、取出7.5μl PCR反应混合物;

2、在反应混合物中加入0.5 μl (10 units)的核酸外切酶 I (20000 units/ml), 37℃反应15分钟;

3、再加入1μl10×AP Buffer 1μl (5 units) 热敏磷酸酶,37℃反应15分钟;如果反应时间延长,可减少酶用量,需试验验证。热失活核酸外切酶 I和热

敏磷酸酶:80℃保温20分钟,终止反应。反应物可直接用于测序。

操作步骤:

1、取出7.5μl PCR反应混合物;

2、在反应混合物中加入0.5 μl (10 units)的核酸外切酶 I (20000 units/ml), 37℃反应15分钟;

3、再加入1μl10×AP Buffer 1μl (5 units) 热敏磷酸酶,37℃反应15分钟;如果反应时间延长,可减少酶用量,需试验验证。热失活核酸外切酶 I和热

敏磷酸酶:80℃保温20分钟,终止反应。反应物可直接用于测序。

本试剂盒为您提供了8 种耐热聚合酶和相应的精心配制的缓冲液,其中缓冲液的pH值,盐离子浓度和助溶剂成分等各不相同,当扩增某些复杂的基因模板等出现问题时,应测试不同的聚合酶及反应缓冲体系。另外,本试剂盒还提供了PCR增剂,能增加引物的特异性,提高DNA聚合酶的热稳定性,适应较宽范围的退火温度和Mg2+ 度。可以在试剂盒提供的8种聚合酶及相应反应体系的基础上再添加PCR增剂,以找到PCR适反应体系从而达到佳的PCR反应效果。

为什么选择本试剂盒?
影响PCR反应的因素很多,如聚合酶本身的性质,pH值,酶保护剂,助溶剂等,只有在这些因素都是适的情况下才能获得较好的扩增产物。

实验步骤:
(1)实验开始前将RNA提取液于65℃水浴锅中预热,离心管中加入ME(巯基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)
(2)取约0.8g菌丝体(液体培养获得的菌丝用真空抽滤即可!固体培养就更好说了),在液氮中迅速磨成精细粉末,装入50mL离心管,按1g材料8mL的量加入预热的RNA提取液,颠倒混匀  
(3)65℃水浴3-10 min,期间混匀2-3次
(4)加入等体积的酚(注意是酸酚pH4.5)::异戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(5)取上清,等体积的:异戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(6)加入1/4V体积10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或过夜)
(7)10,000rpm,4℃离心20min
(8)弃上清,用500ul SSTE溶解沉淀
(9)酚::异戊醇(25:24:1)抽提两次,:异戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)
(10)加2V体积的无水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上
(11)12,000rpm,4℃离心20 min
(12)弃上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥
(13)加200ul的DEPC处理水溶解
(14)用非变性琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计扫描检测RNA的质量
(在抽提过程中,若蛋白质含量或其它的杂质还较多,可以增加抽提次数)
操作步骤:
1. 匀浆处理:a.组织 将组织在液氮中磨碎,每50-100mg组织加入1ml TRIzol,用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过TRIzol体积10℅。
b.单层培养细胞 直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞,每10cm2面积(即3.5cm直径的培养板)加1ml,用移液器吸打几次。TRIzol的用量应根据培养板面积而定,不取决于细胞数。TRIzol加量不足可能导致提取的RNA有DNA污染。
c.细胞悬液 离心收集细胞,每5-10×106动物、植物、酵母细胞或1×107细菌细胞加入1ml TRIzol,反复吸打。加TRIzol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。产品仅用于科研
2.将匀浆样品在室温(15-30℃)放置5分钟,使核酸蛋白复合物完全分离。
3.可选步骤:如样品中含有较多蛋白质,脂肪,多糖或胞外物质(肌肉,植物结节部分等)可于2-8℃10000×g离心10分钟,取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜,多糖,高分子量DNA,上清中含有RNA。处理脂肪组织时,上层有大量油脂应去除。取澄清的匀浆液进行下一步操作。
5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml,剧烈振荡15秒,室温放置3分钟。
6. 2-8℃10000×g离心15分钟。样品分为三层:底层为黄色有机相,上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中,水相体积约为所用TRIzol试剂的60℅。
7. 把水相转移到新管中,如要分离DNA和蛋白质可保留有机相,进一步操作见后。用异丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml异丙醇,室温放置10分钟。
8. 2-8℃10000×g离心10分钟,离心前看不出RNA沉淀,离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。

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