上海莼试生物技术有限公司
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分子生物学试剂 > 核酸扩增 > 耐热逆转录酶I
产品名称:
耐热逆转录酶I
型号:
CS-01F97210
生产地址
国产
产品价格
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产品简介
耐热逆转录酶I现货供应,价格实惠。
产品详情

一、概述:

产品属性: 

产品名称

英文名称

规格

货号

耐热逆转录酶I

Reverse Transcriptase I

2000U

CS-01F97210

本产品是在M-MLV (RNase H-) Reverse Transcriptase基础上经过多点突变得到的全新逆转录酶。本产品热稳定性提高,在50℃下活性高,且可耐受高达55℃的反应温度,适用于具有二级结构的RNA模板的逆转录,能稳定可靠地合成cDNA。该酶与模板的亲和力增,可获得更多全长的cDNA,并可检测到低至1 pg的总RNA,特别适合少量模板以及低拷贝基因的逆转录。此外,本品降低了逆转录过程的错配率,提高了克隆的保真度。

质量控制

核酸外切酶残留检测:200 U本品和0.6 μλ-Hind Ⅲ在37 oC下孵育1小时,DNA的电泳谱带不发生变化。

核酸内切酶残留检测:200 U本品和0.6 μg Supercoiled pBR322 DNA37 oC下孵育1小时,DNA的电泳谱带不发生变化。

RNase残留检测:200 U本品和1 μg小鼠总RNA37 oC下孵育1小时,RNA电泳谱带不发生变化。

功能检测1:逆转录体系中加入200 U本品,以500 ng Hela cell total RNA为模板,Oligo(dT)18为引物,50 oC反应45分钟。取10% cDNA产物进行PCR扩增DNCH基因。琼脂糖凝胶电泳,EB染色,可见有单一的5.6 kb条带。

功能检测2:逆转录体系中加入200 U本品,以100 pg Hela cell total RNA为模板,Oligo(dT)18为引物,50 oC反应30分钟。取10% cDNA产物进行PCR扩增β-actin基因。琼脂糖凝胶电泳,EB染色,可见有单一的550 bp条带。

注意事项

1)请保持实验区域洁净;操作时需穿戴干净的手套、口罩;实验所用的离心管、枪头等耗材均需保证RNase free,以防止RNase污染。

2)为保证逆转录成功,建议使用高质量的RNA样本。
3)为了您的健康,实验操作时请穿实验服和带一次性手套。

实验步骤:
(1)实验开始前将RNA提取液于65℃水浴锅中预热,离心管中加入ME(巯基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)
(2)取约0.8g菌丝体(液体培养获得的菌丝用真空抽滤即可!固体培养就更好说了),在液氮中迅速磨成精细粉末,装入50mL离心管,按1g材料8mL的量加入预热的RNA提取液,颠倒混匀  
(3)65℃水浴3-10 min,期间混匀2-3次
(4)加入等体积的酚(注意是酸酚pH4.5)::异戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(5)取上清,等体积的:异戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(6)加入1/4V体积10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或过夜)
(7)10,000rpm,4℃离心20min
(8)弃上清,用500ul SSTE溶解沉淀
(9)酚::异戊醇(25:24:1)抽提两次,:异戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)
(10)加2V体积的无水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上
(11)12,000rpm,4℃离心20 min
(12)弃上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥
(13)加200ul的DEPC处理水溶解
(14)用非变性琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计扫描检测RNA的质量
(在抽提过程中,若蛋白质含量或其它的杂质还较多,可以增加抽提次数)
操作步骤:
1. 匀浆处理:a.组织 将组织在液氮中磨碎,每50-100mg组织加入1ml TRIzol,用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过TRIzol体积10℅。
b.单层培养细胞 直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞,每10cm2面积(即3.5cm直径的培养板)加1ml,用移液器吸打几次。TRIzol的用量应根据培养板面积而定,不取决于细胞数。TRIzol加量不足可能导致提取的RNA有DNA污染。
c.细胞悬液 离心收集细胞,每5-10×106动物、植物、酵母细胞或1×107细菌细胞加入1ml TRIzol,反复吸打。加TRIzol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。产品仅用于科研
2.将匀浆样品在室温(15-30℃)放置5分钟,使核酸蛋白复合物完全分离。
3.可选步骤:如样品中含有较多蛋白质,脂肪,多糖或胞外物质(肌肉,植物结节部分等)可于2-8℃10000×g离心10分钟,取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜,多糖,高分子量DNA,上清中含有RNA。处理脂肪组织时,上层有大量油脂应去除。取澄清的匀浆液进行下一步操作。
5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml,剧烈振荡15秒,室温放置3分钟。
6. 2-8℃10000×g离心15分钟。样品分为三层:底层为黄色有机相,上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中,水相体积约为所用TRIzol试剂的60℅。
7. 把水相转移到新管中,如要分离DNA和蛋白质可保留有机相,进一步操作见后。用异丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml异丙醇,室温放置10分钟。
8. 2-8℃10000×g离心10分钟,离心前看不出RNA沉淀,离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。

标签:耐热逆转录酶I 2000U 

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