20×Sybr Green I(荧光定量PCR级)CS-01F97174_上海莼试生物技术有限公司

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一、概述：

产品属性：

产品名称	英文名称	规格	货号
20×Sybr Green I(荧光定量PCR级)	20×Sybr Green I(qPCR Grade)	20μl×100次\|20μl×1000次	CS-01F97174

本品SYBR Green I与dsDNA 结合荧光信号可增800～1000倍。在PCR反应体系中，加入过量SYBR Green I荧光染料，它特异性地掺入DNA双链后，荧光信号增，而不掺入链中的SYBR Green I染料分子荧光不变，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。荧光可以在退火阶段或者延伸阶段测定。

使用方法：将20×SYBR Green I浓缩液加入到PCR反应体系，使终浓度为0.5× （0.2×到1×之间调整）。

注意事项：

1．使用浓度对荧光PCR结果的影响

SYBR Green I的使用浓度是保证荧光定量PCR实验成功非常关键的因素。如果SYBR Green I的浓度过低会使荧光信号的变化降低，这就意味着低拷贝的样品可能无法检出。而在高浓度时，将会抑制PCR反应，降低PCR反应效率。所以一般在使用SYBR Green I时应根据实际情况优化使用浓度，反应的终浓度为0.2×到1×之间。

2．镁离子浓度的影响

提高镁离子浓度可以降低SYBR Green I对PCR反应的抑制作用。我们建议在用SYBR Green I进行荧光PCR反应时，镁离子浓度比无SYBR Green I 的普通 PCR 反应高出0.5～3mM。

储存条件：-20℃，避免反复冻融。
本制品别名：PCR级Sybr Green I

实验步骤：

(1)实验开始前将RNA提取液于65℃水浴锅中预热,离心管中加入ME(巯基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取约0.8g菌丝体(液体培养获得的菌丝用真空抽滤即可！固体培养就更好说了),在液氮中迅速磨成精细粉末,装入50mL离心管,按1g材料8mL的量加入预热的RNA提取液,颠倒混匀

(3)65℃水浴3-10 min,期间混匀2-3次

(4)加入等体积的酚(注意是酸酚pH4.5)::异戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等体积的:异戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V体积10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或过夜)

(7)10,000rpm,4℃离心20min

(8)弃上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::异戊醇(25:24:1)抽提两次,:异戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V体积的无水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃离心20 min

(12)弃上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC处理水溶解

(14)用非变性琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计扫描检测RNA的质量

(在抽提过程中,若蛋白质含量或其它的杂质还较多,可以增加抽提次数)

操作步骤:

1. 匀浆处理:a.组织将组织在液氮中磨碎,每50-100mg组织加入1ml TRIzol,用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过TRIzol体积10℅。

b.单层培养细胞直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞，每10cm2面积(即3.5cm直径的培养板)加1ml，用移液器吸打几次。TRIzol的用量应根据培养板面积而定，不取决于细胞数。TRIzol加量不足可能导致提取的RNA有DNA污染。

c．细胞悬液离心收集细胞，每5-10×106动物、植物、酵母细胞或1×107细菌细胞加入1ml TRIzol，反复吸打。加TRIzol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。产品仅用于科研

2．将匀浆样品在室温（15-30℃）放置5分钟，使核酸蛋白复合物完全分离。

3．可选步骤：如样品中含有较多蛋白质，脂肪，多糖或胞外物质（肌肉，植物结节部分等）可于2-8℃10000×g离心10分钟，取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。处理脂肪组织时，上层有大量油脂应去除。取澄清的匀浆液进行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，剧烈振荡15秒，室温放置3分钟。

6. 2-8℃10000×g离心15分钟。样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIzol试剂的60℅。

7. 把水相转移到新管中，如要分离DNA和蛋白质可保留有机相，进一步操作见后。用异丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml异丙醇，室温放置10分钟。

8. 2-8℃10000×g离心10分钟，离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。

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