Fluo-2、Fluo-3和Fluo-4在与Ca2+结合后荧光增，与紫外激发的探针fura-2和indo-1不同，不会发生光谱漂移。荧光光密度在与Ca2+结合后，增至少100倍。

加载细胞说明

加载细胞，建议使用膜透性的AM酯类形式的探针，如下操作建议仅供参考。

使用前将染料用无水DMSO溶解制成染料的DMSO储液（2～5mM，Fluo-8 MW:1046.93），再用合适培养基稀释一份染料的DMSO储液（2～5mM）到1～10μM的终浓度，加入非离子型去污剂Pluronic F-127可以协助非极性的AM酯在水溶液中的扩散。可以简单的通过先等体积混合20%（w/V）的Pluronic与DMSO，确保Pluronic在加载到细胞中的工作浓度是0.02%。

有机阴离子转运抑制剂probenecid（1～2.5mM）或sulfinpyrazone (0.1～0.25mM)可以添加到细胞培养基中，以减少探针在胞脱酯现象。外的Probenecid和sulfinpyrazone储液基本为碱性，因此在添加到培养基中时需要先调整到与所用培养基匹配的pH。

细胞通常可以与AM酯探针在20～37℃条件下孵育20～60分钟，佳的探针加载浓度、时长与温度需要在实验中具体摸索确定。一般来说为了减少可能的毒性负荷，只要满足足够的荧光检测度，选择尽可能低的染料浓度。此外，由于亚细胞结构的分区化特点，AM酯加载技术存在固有的标记问题，这可以通过降低孵育温度来解决。
在进行荧光检测之前，细胞应用无指示剂的培养基（允许的话，可以添加阴离子转运抑制剂）充分洗涤，以确保洗去细胞表面的非特异性染料吸附，再另外以新鲜培养基孵育30分钟保证胞内酯酶水解充分进行。这里，可能会有少量的指示剂逸出胞外从而产生背景荧光，可以通过临将上机检测之前，在外培养基中添加抗荧光素抗体，来降低背景。