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分子生物学试剂 > 探针标记及检测 > 氯离子荧光探针 MEQ (6-甲氧-N-乙基喹啉碘)(CoFM FACS)
产品名称:
氯离子荧光探针 MEQ (6-甲氧-N-乙基喹啉碘)(CoFM FACS)
型号:
CS-01F96972
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国产
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产品简介
氯离子荧光探针 MEQ (6-甲氧-N-乙基喹啉碘)(CoFM FACS)现货供应,价格实惠。
产品详情

一、概述:

产品属性: 

产品名称

英文名称

规格

货号

氯离子荧光探针 MEQ (6-甲氧-N-乙基喹啉碘)(CoFM FACS)

MEQ(MQAE)

10mg

CS-01F96972

 MEQMQAE)是一个6-甲氧基花青苷衍生物,是细胞内的Cl-荧光指示剂,该染料可以通过受被动扩散所控制的碰撞淬灭来检测离子浓度。目前,检测Cl-所用荧光染料主要是MQAE SPQMQAE 相比SPQ 来说对于Cl-的浓度有更高的灵敏度和更高的荧光量子比率。

MQAE 的工作液可以配制于Krebs-HEPES 缓冲液中。Krebs-HEPES 缓冲液即为20mM HEPES128mM NaCl2.5mM KCl2.7mMCaCl21mM MgCl216mM glucosepH7.4MQAE 标记细胞时的浓度通常为5-10mM。以约800-1000 万细胞每毫升的细胞密度,在含有5-10mM MQAE Krebs-HEPES 缓冲液中孵育30-60 分钟。通常一个探针的装载体系为100 微升即可。随后用Krebs-HEPES缓冲液或其它适当溶液洗涤5 次左右,即可进行相应荧光测定。详细的使用方法请参考相关文献。以下对胞内氯离子的荧光测量[Cl-]做简要说明计算。Stem-Volmer 方程可以给出氯离子探针的荧光度与氯离子浓度的关系:

(FO/F) – 1 = KSV[Q]

FO 是没有卤化物或其他淬灭离子时的荧光度,F 是有淬灭剂时的荧光度,[Q]是淬灭剂浓度,而KSV Stem-Volmer 方程常数。建议对实验体系进行校准,以得到研究用细胞类型的指示剂探针的Ksv,利用线性回归模型分析Stem-Volmer 方程。Stem-Volmer 方程中的氯离子Ksv 常数可以随着碰撞淬灭的阴离子物质的增多而明显降低,如多肽。便于校准,可以固定胞内氯离子的浓度,通过使用双三丁基氧化锡和尼日利亚菌素10~30μM。为了保证渗透压好使用阴离子不淬灭染料,取代氯离子,如葡萄糖酸。
储存:-20℃,避光,有效期6个月。

实验步骤:
(1)实验开始前将RNA提取液于65℃水浴锅中预热,离心管中加入ME(巯基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)
(2)取约0.8g菌丝体(液体培养获得的菌丝用真空抽滤即可!固体培养就更好说了),在液氮中迅速磨成精细粉末,装入50mL离心管,按1g材料8mL的量加入预热的RNA提取液,颠倒混匀  
(3)65℃水浴3-10 min,期间混匀2-3次
(4)加入等体积的酚(注意是酸酚pH4.5)::异戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(5)取上清,等体积的:异戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(6)加入1/4V体积10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或过夜)
(7)10,000rpm,4℃离心20min
(8)弃上清,用500ul SSTE溶解沉淀
(9)酚::异戊醇(25:24:1)抽提两次,:异戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)
(10)加2V体积的无水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上
(11)12,000rpm,4℃离心20 min
(12)弃上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥
(13)加200ul的DEPC处理水溶解
(14)用非变性琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计扫描检测RNA的质量
(在抽提过程中,若蛋白质含量或其它的杂质还较多,可以增加抽提次数)
操作步骤:
1. 匀浆处理:a.组织 将组织在液氮中磨碎,每50-100mg组织加入1ml TRIzol,用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过TRIzol体积10℅。
b.单层培养细胞 直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞,每10cm2面积(即3.5cm直径的培养板)加1ml,用移液器吸打几次。TRIzol的用量应根据培养板面积而定,不取决于细胞数。TRIzol加量不足可能导致提取的RNA有DNA污染。
c.细胞悬液 离心收集细胞,每5-10×106动物、植物、酵母细胞或1×107细菌细胞加入1ml TRIzol,反复吸打。加TRIzol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。产品仅用于科研
2.将匀浆样品在室温(15-30℃)放置5分钟,使核酸蛋白复合物完全分离。
3.可选步骤:如样品中含有较多蛋白质,脂肪,多糖或胞外物质(肌肉,植物结节部分等)可于2-8℃10000×g离心10分钟,取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜,多糖,高分子量DNA,上清中含有RNA。处理脂肪组织时,上层有大量油脂应去除。取澄清的匀浆液进行下一步操作。
5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml,剧烈振荡15秒,室温放置3分钟。
6. 2-8℃10000×g离心15分钟。样品分为三层:底层为黄色有机相,上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中,水相体积约为所用TRIzol试剂的60℅。
7. 把水相转移到新管中,如要分离DNA和蛋白质可保留有机相,进一步操作见后。用异丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml异丙醇,室温放置10分钟。
8. 2-8℃10000×g离心10分钟,离心前看不出RNA沉淀,离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。

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