产品属性: 产品名称 | 英文名称 | 规格 | 货号 |
超级电泳液 | Superbuffer | 250mL | CS-01F96731 |
本品是我司开发的级核酸电泳液套装,其中的溶液A含抗水解的核酸染料,用于配制琼脂糖凝胶(溶液A也可用于电泳,但不经济);溶液B为不含染料的电泳液。
产品特点: 1.高浓度,溶液A和溶液B用去离子水稀释100倍后可以直接用作配胶工作液和电泳工作液,100mL的产品可以配制10L工作液。 2.低产热,用溶液A配制的胶在溶液B配制的电泳液中电泳时可用30 V/cm的中等电压(cm是指电泳槽两电级之间的距离),一般的mini胶电泳(如检查PCR扩增)只需要5-10分钟即可完成,比TAE和TBE快4-5倍(TAE和TBE电泳一般需要40分钟)。当然,也可以按常规的电泳参数电泳,所需时间约为40分钟左右。 3.用本产品溶液A配制的琼脂糖凝胶可以在TBE和TAE缓冲液中低压电泳。用TBE配制的琼脂糖凝胶也可以在本产品溶液B配制的电泳液中电泳(低压中压均可)。但用TAE配制的胶不能在溶液B中电泳。 4.用本产品电泳得到的DNA片段的胶回收率高于使用TAE和TBE电泳的胶回收,不影响后续的DNA胶回收和DNA连接等反应。 5.溶液A(配胶用)和溶液B(电泳用)均可以单独购买。 储存条件:常温保存和运输,有效期两年。如果本产品有沉淀析出现象,请65℃水浴溶解后使用。 使用方法: 将本品溶液A用去离子水稀释100倍(1mL溶液A加99mL去离子水),混匀后直接用于配琼脂糖胶,溶液B用去离子水稀释100倍(1mL本产品加99mL去离子水)后直接用于做电泳液,其余操作跟TAE,TBE缓冲液一样。 |
实验步骤:
(1)实验开始前将RNA提取液于65℃水浴锅中预热,离心管中加入ME(巯基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)
(2)取约0.8g菌丝体(液体培养获得的菌丝用真空抽滤即可!固体培养就更好说了),在液氮中迅速磨成精细粉末,装入50mL离心管,按1g材料8mL的量加入预热的RNA提取液,颠倒混匀
(3)65℃水浴3-10 min,期间混匀2-3次
(4)加入等体积的酚(注意是酸酚pH4.5)::异戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(5)取上清,等体积的:异戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(6)加入1/4V体积10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或过夜)
(7)10,000rpm,4℃离心20min
(8)弃上清,用500ul SSTE溶解沉淀
(9)酚::异戊醇(25:24:1)抽提两次,:异戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)
(10)加2V体积的无水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上
(11)12,000rpm,4℃离心20 min
(12)弃上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥
(13)加200ul的DEPC处理水溶解
(14)用非变性琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计扫描检测RNA的质量
(在抽提过程中,若蛋白质含量或其它的杂质还较多,可以增加抽提次数)
操作步骤:
1. 匀浆处理:a.组织 将组织在液氮中磨碎,每50-100mg组织加入1ml TRIzol,用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过TRIzol体积10℅。
b.单层培养细胞 直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞,每10cm2面积(即3.5cm直径的培养板)加1ml,用移液器吸打几次。TRIzol的用量应根据培养板面积而定,不取决于细胞数。TRIzol加量不足可能导致提取的RNA有DNA污染。
c.细胞悬液 离心收集细胞,每5-10×106动物、植物、酵母细胞或1×107细菌细胞加入1ml TRIzol,反复吸打。加TRIzol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。产品仅用于科研
2.将匀浆样品在室温(15-30℃)放置5分钟,使核酸蛋白复合物完全分离。
3.可选步骤:如样品中含有较多蛋白质,脂肪,多糖或胞外物质(肌肉,植物结节部分等)可于2-8℃10000×g离心10分钟,取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜,多糖,高分子量DNA,上清中含有RNA。处理脂肪组织时,上层有大量油脂应去除。取澄清的匀浆液进行下一步操作。
5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml,剧烈振荡15秒,室温放置3分钟。
6. 2-8℃10000×g离心15分钟。样品分为三层:底层为黄色有机相,上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中,水相体积约为所用TRIzol试剂的60℅。
7. 把水相转移到新管中,如要分离DNA和蛋白质可保留有机相,进一步操作见后。用异丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml异丙醇,室温放置10分钟。
8. 2-8℃10000×g离心10分钟,离心前看不出RNA沉淀,离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。