产品属性: 产品名称 | 英文名称 | 规格 | 货号 |
绿如蓝核酸染料(UV) | DNAgreen(UV) | 1.5mL | CS-01F96720 |
目前常见的替代EB的核酸染料SYBR Green I(属于花氰类染料)虽然毒性比EB低、灵敏度比EB高,但由于其化学稳定性差(怕光、怕水、怕热),实验结果的重复性往往不尽人意;此外,SYBR Green I在电泳过程中能在DNA分子间移位,很容易使DNA 条带模糊和扭曲,电泳清晰度和分辨率也不如EB。所以在实际应用中依然不能有效替代EB。本产品是同时具有EB 稳定性和SYBR Green I低毒性的新性核酸染料
产品特点: 1.低毒。其主要成分未发现对人体有致癌性、未被列入有毒有害品,有利于保护使用者的健康和保护日益恶化的环境。 2. 灵敏。检测灵敏度跟EB相当,能满足常规核酸电泳实验要求。 3. 稳定。对光、水和热的稳定性跟EB相当,可加入琼脂糖凝胶中反复熔化。 4. 无分子间位移现象。不会出现SYBR染料常见的条带模糊和扭曲现象。 5. 使用方法多样。既可以加入熔化的胶中,也可以电泳后染色,还可用于PAGE。 6.跟各种常用的核酸电泳缓冲液(如SuperBuffer-2、TBE、TAE)兼容,但在SuperBuffer-2和TBE中背景低。 7. 观察时不需要任何额外的仪器设备或UV光源,可以使用现成的观察EB的300nm UV。 8.可用于RNA染色(也呈绿色)。 9. DNA或RNA浓度较高时还可以直接在日光下观察(需要将胶放在黑色背景下)。由于避免了UV 对DNA的伤害,尤其适用于胶回收实验。 储存条件:常温运输,4℃保存,有效期一年。 使用方法: 注意:虽然本产品的主要成分未发现对人体有致癌性、未被列入有毒有害品,但操作时好还是戴上塑料手套。 |
实验步骤:
(1)实验开始前将RNA提取液于65℃水浴锅中预热,离心管中加入ME(巯基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)
(2)取约0.8g菌丝体(液体培养获得的菌丝用真空抽滤即可!固体培养就更好说了),在液氮中迅速磨成精细粉末,装入50mL离心管,按1g材料8mL的量加入预热的RNA提取液,颠倒混匀
(3)65℃水浴3-10 min,期间混匀2-3次
(4)加入等体积的酚(注意是酸酚pH4.5)::异戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(5)取上清,等体积的:异戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(6)加入1/4V体积10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或过夜)
(7)10,000rpm,4℃离心20min
(8)弃上清,用500ul SSTE溶解沉淀
(9)酚::异戊醇(25:24:1)抽提两次,:异戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)
(10)加2V体积的无水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上
(11)12,000rpm,4℃离心20 min
(12)弃上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥
(13)加200ul的DEPC处理水溶解
(14)用非变性琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计扫描检测RNA的质量
(在抽提过程中,若蛋白质含量或其它的杂质还较多,可以增加抽提次数)
操作步骤:
1. 匀浆处理:a.组织 将组织在液氮中磨碎,每50-100mg组织加入1ml TRIzol,用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过TRIzol体积10℅。
b.单层培养细胞 直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞,每10cm2面积(即3.5cm直径的培养板)加1ml,用移液器吸打几次。TRIzol的用量应根据培养板面积而定,不取决于细胞数。TRIzol加量不足可能导致提取的RNA有DNA污染。
c.细胞悬液 离心收集细胞,每5-10×106动物、植物、酵母细胞或1×107细菌细胞加入1ml TRIzol,反复吸打。加TRIzol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。产品仅用于科研
2.将匀浆样品在室温(15-30℃)放置5分钟,使核酸蛋白复合物完全分离。
3.可选步骤:如样品中含有较多蛋白质,脂肪,多糖或胞外物质(肌肉,植物结节部分等)可于2-8℃10000×g离心10分钟,取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜,多糖,高分子量DNA,上清中含有RNA。处理脂肪组织时,上层有大量油脂应去除。取澄清的匀浆液进行下一步操作。
5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml,剧烈振荡15秒,室温放置3分钟。
6. 2-8℃10000×g离心15分钟。样品分为三层:底层为黄色有机相,上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中,水相体积约为所用TRIzol试剂的60℅。
7. 把水相转移到新管中,如要分离DNA和蛋白质可保留有机相,进一步操作见后。用异丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml异丙醇,室温放置10分钟。
8. 2-8℃10000×g离心10分钟,离心前看不出RNA沉淀,离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。