上海莼试生物技术有限公司
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分子生物学试剂 > DNA提取纯化 > 无内毒素质粒中量提取试剂盒(50~100ml)
产品名称:
无内毒素质粒中量提取试剂盒(50~100ml)
型号:
CS-01F96600
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国产
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产品简介
无内毒素质粒中量提取试剂盒(50~100ml)现货供应,价格实惠。
产品详情

一、概述:

产品属性:

产品名称

英文名称

规格

货号

无内毒素质粒中量提取试剂盒(50100ml)

EndoFree Midi Plasmid DNA Kit(50-100ml)

10

CS-01F96600

本试剂盒采用独特的硅胶膜吸附技术,高效专一地结合质粒DNA。同时采用特殊的溶液EBT和过滤器CS1,可有效的去除内毒素、蛋白等杂质;整个提取过程仅需1小时,方便快捷。提取的质粒适用于酶切、测序、细胞转化、细胞转染、显微注射等分子生物学及细胞生物学实验。

产品特点:

适用于从50100mL菌液中提取质。

所获得质粒内毒素残留低,满足于高质量的转染。

采用独特的快速内毒素去除方法,操作更为便捷。

保存条件:

室温(1525)干燥条件下,可保存12个月;更长时间的保存可置于28℃。28℃保存时,若溶液产生沉淀,应在使用前置于37℃溶解沉淀。次使用前将RNase A加入溶液P1中,混匀后置于28℃保存,可稳定保存6个月。单独包装的RNase A在室温可稳定保存12个月。

注意事项:(请务必在使用本试剂盒之前阅读此注意事项)

溶液P1在使用前先加入RNase A(将试剂盒中提供的RNase A全部加入),混匀,置于28℃保存。

次使用前应按照试剂瓶标签的说明现在漂洗液PWFMRDE中加入无水乙醇。

使用前先检查平衡液BL、溶液P2、溶液E3和溶液EBT是否出现结晶或者沉淀,如有结晶或者沉淀现象,可在37℃水浴中加热几分钟,即可恢复澄清。

注意皮肤不能直接接触溶液P2E3EBT,使用后应立即盖紧盖子。

使用过滤器时请将推柄小心缓慢地从过滤管中抽出,避免滤膜因压力而松动。

提取的质粒量与细菌培养浓度、质粒拷贝数等因素有关。如果所提质粒为低拷贝质粒或大于10kb的大质粒,应加大菌体使用量,同时按比例增加P1P2E3EBT的用量;洗脱缓冲液推荐在6570℃水浴中预热(可以适当延长吸附和洗脱时间,以提高提取效率)。

实验前使用平衡液BL处理吸附柱,可以大限度激活硅基质膜,提高得率。

用平衡液处理过的柱子好立即使用,放置时间过长会影响使用效果。

实验步骤:
(1)实验开始前将RNA提取液于65℃水浴锅中预热,离心管中加入ME(巯基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)
(2)取约0.8g菌丝体(液体培养获得的菌丝用真空抽滤即可!固体培养就更好说了),在液氮中迅速磨成精细粉末,装入50mL离心管,按1g材料8mL的量加入预热的RNA提取液,颠倒混匀  
(3)65℃水浴3-10 min,期间混匀2-3次
(4)加入等体积的酚(注意是酸酚pH4.5)::异戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(5)取上清,等体积的:异戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(6)加入1/4V体积10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或过夜)
(7)10,000rpm,4℃离心20min
(8)弃上清,用500ul SSTE溶解沉淀
(9)酚::异戊醇(25:24:1)抽提两次,:异戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)
(10)加2V体积的无水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上
(11)12,000rpm,4℃离心20 min
(12)弃上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥
(13)加200ul的DEPC处理水溶解
(14)用非变性琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计扫描检测RNA的质量
(在抽提过程中,若蛋白质含量或其它的杂质还较多,可以增加抽提次数)
操作步骤:
1. 匀浆处理:a.组织 将组织在液氮中磨碎,每50-100mg组织加入1ml TRIzol,用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过TRIzol体积10℅。
b.单层培养细胞 直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞,每10cm2面积(即3.5cm直径的培养板)加1ml,用移液器吸打几次。TRIzol的用量应根据培养板面积而定,不取决于细胞数。TRIzol加量不足可能导致提取的RNA有DNA污染。
c.细胞悬液 离心收集细胞,每5-10×106动物、植物、酵母细胞或1×107细菌细胞加入1ml TRIzol,反复吸打。加TRIzol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。产品仅用于科研
2.将匀浆样品在室温(15-30℃)放置5分钟,使核酸蛋白复合物完全分离。
3.可选步骤:如样品中含有较多蛋白质,脂肪,多糖或胞外物质(肌肉,植物结节部分等)可于2-8℃10000×g离心10分钟,取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜,多糖,高分子量DNA,上清中含有RNA。处理脂肪组织时,上层有大量油脂应去除。取澄清的匀浆液进行下一步操作。
5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml,剧烈振荡15秒,室温放置3分钟。
6. 2-8℃10000×g离心15分钟。样品分为三层:底层为黄色有机相,上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中,水相体积约为所用TRIzol试剂的60℅。
7. 把水相转移到新管中,如要分离DNA和蛋白质可保留有机相,进一步操作见后。用异丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml异丙醇,室温放置10分钟。
8. 2-8℃10000×g离心10分钟,离心前看不出RNA沉淀,离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。

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