上海莼试生物技术有限公司
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分子生物学试剂 > DNA提取纯化 > 无内毒素质粒中量提取试剂盒(40~60mL)
产品名称:
无内毒素质粒中量提取试剂盒(40~60mL)
型号:
CS-01F96590
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产品简介
无内毒素质粒中量提取试剂盒(40~60mL)现货供应,价格实惠。
产品详情

一、概述:

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规格

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无内毒素质粒中量提取试剂盒(4060mL)

Plasmid Midi Kit(40-60mL)

20|40

CS-01F96590

本试剂盒用碱裂解法从培养菌中提取质粒DNA,采用独特的溶液配方和内毒素清除试剂,只需要几次简单离心去除蛋白质、多糖、内毒素、RNA等杂质,获得高质量的质粒DNA。纯化DNAOD260/280通常在1.8左右,得到的质粒可直接应用于细胞转染甚至动物体内实验等对DNA纯度要求很高的工作中。纯化后期过程均在1.5mL小离心管中操作,方法简单,不需特殊设备,无需过柱,不用酚氯仿抽提;基本可完全回收细菌裂解释放出的质粒,不必担心质粒DNA的丢失。本方法提取纯化质粒DNA,对质粒损伤小,即使是10kb甚至100kb以上的大型质粒或大型BAC/PAC质粒,只要碱裂解法能够提取,就可以有效纯化。可选择任意小体积溶解质粒,浓度可高达5μg/μl。螺旋比例可高达95%,无内毒素,转染效果好。

试剂盒特点:

不需要使用有毒的,氯仿等试剂,也不需要乙醇沉淀。快速、方便、从5070mL大肠杆菌LB((Luria-Bertani)培养液中,可快速提取100250μg纯净的高拷贝质粒DNA,提取率达8090%

获得的质粒产量高,浓度高,螺旋比例高,纯度好,可直接用于酶切、转化、PCR、体外转录、测序等各种分子生物学实验。

内毒素含量极低(<0.1 EU/μg DNA),可直接应用于细胞转染。

保存:室温储存12个月不影响使用效果。

保存事项:

次使用时,将试剂盒所带全部的RNase A加入溶液P1后(终浓度100μg/ml)置于4℃保存。如果溶液P1RNase A失活,提取的质粒可能会混杂有微量RNA残留,在溶液P1中补加RNase A即可。

内毒素清除剂在4℃可保存一个月,如果要长期保存,建议保存在-20!

环境温度低时溶液P2SDS可能会析出出现浑浊或者沉淀,可在37℃水浴加热几分钟,即可恢复澄清,不要剧烈摇晃,以免形成过量的泡沫。

避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、pH值变化,各溶液使用后应及时盖紧盖子。

注意事项:

提取的质粒量与细菌培养浓度、质粒拷贝数等因素有关。如果所提质粒为低拷贝质粒或大于10kb的大质粒,应加大菌体使用量,同时按比例增加P1P2PⅢ的用量。

提取大质粒时操作动作要轻柔,应该使用剪大了开口的吸头,防止机械剪切对DNA的损坏。

DNA沉淀液沉淀离心后,可能看不到明显沉淀。如未见沉淀,担心DNA丢失,可保留上清液,待完成全部操作后电泳鉴定,以确定是否获得终产物(数百微克DNA离心沉淀在管的侧壁上,可能无法看到明显团块)。

得到的质粒DNA可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。OD260值为1相当于大约50μg/ml DNA。电泳可能为单一条带,也可能为2条或者多条DNA条带,这主要是不同程度的螺旋构象质粒泳动位置不一造成,与提取物培养时间长短、提取时操作剧烈程度等有关。本公司产品正常操作情况下基本螺旋可以过95%

 

质粒DNA确切分子大小,必须酶切线性化后,对比DNA分子量Marker才可以知道。处于环状或者螺旋状态的质粒,泳动位置不确定,无法通过电泳知道确切大小。

实验步骤:
(1)实验开始前将RNA提取液于65℃水浴锅中预热,离心管中加入ME(巯基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)
(2)取约0.8g菌丝体(液体培养获得的菌丝用真空抽滤即可!固体培养就更好说了),在液氮中迅速磨成精细粉末,装入50mL离心管,按1g材料8mL的量加入预热的RNA提取液,颠倒混匀  
(3)65℃水浴3-10 min,期间混匀2-3次
(4)加入等体积的酚(注意是酸酚pH4.5)::异戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(5)取上清,等体积的:异戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(6)加入1/4V体积10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或过夜)
(7)10,000rpm,4℃离心20min
(8)弃上清,用500ul SSTE溶解沉淀
(9)酚::异戊醇(25:24:1)抽提两次,:异戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)
(10)加2V体积的无水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上
(11)12,000rpm,4℃离心20 min
(12)弃上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥
(13)加200ul的DEPC处理水溶解
(14)用非变性琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计扫描检测RNA的质量
(在抽提过程中,若蛋白质含量或其它的杂质还较多,可以增加抽提次数)
操作步骤:
1. 匀浆处理:a.组织 将组织在液氮中磨碎,每50-100mg组织加入1ml TRIzol,用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过TRIzol体积10℅。
b.单层培养细胞 直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞,每10cm2面积(即3.5cm直径的培养板)加1ml,用移液器吸打几次。TRIzol的用量应根据培养板面积而定,不取决于细胞数。TRIzol加量不足可能导致提取的RNA有DNA污染。
c.细胞悬液 离心收集细胞,每5-10×106动物、植物、酵母细胞或1×107细菌细胞加入1ml TRIzol,反复吸打。加TRIzol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。产品仅用于科研
2.将匀浆样品在室温(15-30℃)放置5分钟,使核酸蛋白复合物完全分离。
3.可选步骤:如样品中含有较多蛋白质,脂肪,多糖或胞外物质(肌肉,植物结节部分等)可于2-8℃10000×g离心10分钟,取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜,多糖,高分子量DNA,上清中含有RNA。处理脂肪组织时,上层有大量油脂应去除。取澄清的匀浆液进行下一步操作。
5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml,剧烈振荡15秒,室温放置3分钟。
6. 2-8℃10000×g离心15分钟。样品分为三层:底层为黄色有机相,上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中,水相体积约为所用TRIzol试剂的60℅。
7. 把水相转移到新管中,如要分离DNA和蛋白质可保留有机相,进一步操作见后。用异丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml异丙醇,室温放置10分钟。
8. 2-8℃10000×g离心10分钟,离心前看不出RNA沉淀,离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。

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