试剂盒特点：

离心吸附柱内硅基质膜全部采用进口世界著名公司特制吸附膜，柱与柱之间吸附量差异极小，可重复性好。克服了国产试剂盒膜质量不稳定的弊端。

快速、方便，不需要使用有毒的、氯仿等试剂，也不需要乙醇沉淀。获得的质粒产量高、纯度好，可以直接用于酶切、转化、PCR、体外转录、测序等各种分子生物学实验。

保存：室温储存12个月不影响使用效果。

保存事项：

次使用时，将试剂盒所带的全部RNaseA加入溶液YP1（终浓度100μg/ml）置于4℃保存。如果溶液YP1中RNase A失活，提取的质粒可能会有微量RNA残留，在溶液YP1中补加RNase A即可。

环境温度低时溶液YP2中SDS可能会析出浑浊或者沉淀，可在37℃水浴加热几分钟，即可恢复澄清，不要剧烈摇晃，以免形成过量的泡沫。

避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、pH值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。

操作步骤：（实验前请先阅读注意事项）

提示：

① 次使用前请先在漂洗液WB瓶中加入量无水乙醇，充分混匀，加入后请及时在方框打钩标记已加入乙醇，以免多次加入!

② 将RNase A全部加入溶液P1中，混匀。每次使用后置于2～8℃保存。

③ 将溶液P3放在冰上预冷。

④ 吸取使用量的Sorbitol buffer加入0.1%β-巯基乙醇，回复到室温备用。

取约100～180毫升酵母培养物，6000×g，离心10分钟，尽可能的倒干上清，收集菌体。

收集过50毫升菌液，可以离心弃上清后，在同一个50mL管内加入更多的菌液，重复步骤1，直到收集到足够的菌体。

加入10mL Sorbitol buffer，轻柔吹打充分重悬细胞；加入0.1g破壁酶（破壁酶临用前用2mL Sorbitol buffer溶解），充分颠倒混匀，37℃温育1～2小时消化细胞壁，中间可颠倒数次帮助消化。

如果破壁效果不好导致质粒产量过低，可以加大破壁酶用量来提高酶工作浓度，还可以延长消化时间或者提高温度到45℃来提高效果，不适合破壁消化的酵母可选用Lyticase或者Zymolase或者其它方法如加玻璃珠涡旋振荡，反复冻融等。

6000×g，离心10分钟，尽可能吸弃上清，加入7mL溶液YP1重悬菌体沉淀，涡旋振荡至彻底悬浮。

如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解，导致提取量和纯度偏低。

加7mL的溶液YP2，温和地上下翻转4～7次使菌体充分裂解，室温放置4分钟。

温和地混合，不要剧烈震荡，以免基因组DNA剪切断裂！所用时间不应过5分钟！以免质粒受到破坏。此时菌液应变得清亮粘稠，如果菌体少，很快清亮粘稠后就可以做下一步，不是一定要准确的5分钟。如果未变得清亮，可能由于菌体过多，裂解不彻底，应减少菌体量。

加10mL溶液YP3，立即温和地上下翻转4～7次，充分混匀此时会出现白色絮状沉淀。冰上静置5～10分钟，4℃，至少2500×g离心20分钟(加大离心力可相应缩短离心时间，如15000×g离心10分钟)，小心取上清，避免吸取到漂浮的白色沉淀。

加入溶液YP3后应该立即混匀，以免产生SDS的局部沉淀，如果上清中还有飘浮白色沉淀，可再次离心后取上清。

可选，一般不需要：4℃，2500×g再次离心10分钟，小心取上清。

将上一步所得上清加入吸附柱DC中（吸附柱放入收集管中），静置2分钟，2500×g离心2分钟，倒掉收集管中的废液。

如果上清体积过20mL，可以分多次过柱。

加入10mL去蛋白液PD，2500×g离心2分钟，弃掉废液。

加入10mL漂洗液WB（请先检查是否已加入无水乙醇!），2500×g离心2分钟，弃掉废液。

重复操作步骤9一次。

将吸附柱DC放回空收集管中，高速（好大于9000×g，如果离心机转速低，需要相应延长离心时间）离心10分钟以干燥膜基质残留乙醇，用枪头吸除内圈压环和柱壁之间可能残留的乙醇，室温或者烘箱晾干几分钟。

该步骤目的为彻底去除吸附柱中残留乙醇，残留乙醇抑制下游反应并且严重降低洗脱效率，降低质粒产量。如果洗脱产量低，则必须加做步骤12。

可选步骤:选择以下两种方法之一干燥柱子：

① 取下柱子放置于真空容器中，密封真空容器，提供真空15分钟；

② 将柱子放置于60～65℃真空干燥箱或烘箱中，放置10～15分钟。

取出吸附柱DC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加1mL洗脱缓冲液EB（洗脱缓冲液事先在65～70℃水浴中预热效果更好），室温放置2分钟，6000×g离心5分钟。如果需要较多量质粒，可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，离心2分钟。

洗脱体积越大，洗脱效率越高，如果需要质粒浓度较高，可以适当减少洗脱体积，但是小体积不应少于0.6mL，体积过小降低质粒洗脱效率，减少质粒产量。