上海莼试生物技术有限公司
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产品名称:
PAGE胶DNA纯化回收试剂盒
型号:
CS-01F96581
生产地址
国产
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产品简介
PAGE胶DNA纯化回收试剂盒现货供应,价格实惠。
产品详情

一、概述:

产品属性:

产品名称

英文名称

规格

货号

PAGEDNA纯化回收试剂盒

PAGE DNA Extraction Kit

50

CS-01F96581

介绍

 

 本试剂盒采用新型硅基质膜离心柱及特殊的缓冲液系统,可从聚丙烯酰胺凝胶中简捷高效回收20bp500bp的短片段DNA片段,回收效率可高达85%。并可大限度去除杂质,获得高纯度的DNA,所得到的DNA可直接用于酶切、连接、测序等后续的分子生物学试验。

产品特点:

适用范围广泛,可以回收20bp2kb的单链或者双链DNA

使用了优质结合液,不含传统结合液的碘化钠和高氯酸盐,不抑制回收后酶切、连接克隆等下游反应。

独特的配方保证了该试剂盒比一般试剂盒回收效率大大提高。

快速、方便离心柱型,不需要使用有毒的、氯仿等试剂,也不需要乙醇沉淀。

保存:RT,有效期12个月

注意事项:

避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、pH值变化,各溶液使用后应及时盖紧盖子。

所有的离心步骤均在室温完成,使用转速可以达到13,000rpm的传统台式离心机。

结合液中含有刺激性化合物,操作时要戴乳胶手套,避免沾染皮肤,眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时,要立即用大量清水或者生理盐水冲洗。

电泳时好使用新的电泳缓冲液,以免影响电泳和回收效果。

切胶时,紫外照射时间应尽量短,以免对DNA造成损伤。也可以选择可见光染料染色后在可见光下切胶会避免紫外对DNA损伤。

回收率与片段大小、凝胶浓度、初始DNA量和洗脱体积有关。

操作步骤:

提示:次使用前请先在漂洗液WB中加入量无水乙醇,加入后请及时打钩标记已加入乙醇,以免多次加入!

切取含DNA片段的PAGE凝胶(100mg左右,尽可能多地把多余的胶切除,否则会影响回收效率),放入1.5mL离心管中,用移液枪头尽可能捣碎(好先在酒精灯上将枪头的口烧密闭再用于捣碎),捣得越细越好。

向凝胶中加入1-2倍体积的Diffusion Buffer (如100mg凝胶加入100-200μL Diffusion Buffer),55℃温浴30分钟-2小时,期间每15分钟涡旋震荡混匀,促进胶中DNA扩散到溶液中。

一般来说,回收片段越大,DNA扩散需要的时间越长,100bp左右的DNA片段温浴30分钟就可以(时间长些也不影响回收效果);

如果回收500bp-1000bpDNA片段,可以将温浴时间延长3-5个小时。也可以37℃温浴12-16小时过夜。

12,000rpm离心5分钟。小心取上清转入新的离心管。记录上清体积。

加入9倍上清体积的Binding Buffer,混匀。回收片段>100bp时,加5倍上清体积的Binding Buffer即可。

将上一步所得溶液加入吸附柱EC中(吸附柱放入收集管中),室温放置1分钟,12,000rpm离心30-60秒,倒掉收集管中的废液。吸附柱大容积为750μL,若溶液体积大于750μL,可分批加入。

加入600μL漂洗液WB(请先检查是否已加入无水乙醇!),12,000rpm离心30秒,弃掉废液。

重复步骤6一遍。

将吸附柱EC放回空收集管中,13,000rpm离心2分钟,尽量除去漂洗液,以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。

取出吸附柱EC,放入一个干净的离心管中,在吸附膜的中间部位加30-50μL洗脱缓冲液EB,室温放置2分钟,12,000rpm离心1分钟。如果需要较高浓度核酸,可将得到的溶液重新加入吸附柱中,离心1分钟。

洗脱体积越大,洗脱效率越高。如果需要核酸浓度较高,可以适当减少洗脱体积,但是小体积不应少于25μL,体积过小降低核酸洗脱效率,减少产量。

实验步骤:
(1)实验开始前将RNA提取液于65℃水浴锅中预热,离心管中加入ME(巯基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)
(2)取约0.8g菌丝体(液体培养获得的菌丝用真空抽滤即可!固体培养就更好说了),在液氮中迅速磨成精细粉末,装入50mL离心管,按1g材料8mL的量加入预热的RNA提取液,颠倒混匀  
(3)65℃水浴3-10 min,期间混匀2-3次
(4)加入等体积的酚(注意是酸酚pH4.5)::异戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(5)取上清,等体积的:异戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(6)加入1/4V体积10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或过夜)
(7)10,000rpm,4℃离心20min
(8)弃上清,用500ul SSTE溶解沉淀
(9)酚::异戊醇(25:24:1)抽提两次,:异戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)
(10)加2V体积的无水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上
(11)12,000rpm,4℃离心20 min
(12)弃上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥
(13)加200ul的DEPC处理水溶解
(14)用非变性琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计扫描检测RNA的质量
(在抽提过程中,若蛋白质含量或其它的杂质还较多,可以增加抽提次数)
操作步骤:
1. 匀浆处理:a.组织 将组织在液氮中磨碎,每50-100mg组织加入1ml TRIzol,用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过TRIzol体积10℅。
b.单层培养细胞 直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞,每10cm2面积(即3.5cm直径的培养板)加1ml,用移液器吸打几次。TRIzol的用量应根据培养板面积而定,不取决于细胞数。TRIzol加量不足可能导致提取的RNA有DNA污染。
c.细胞悬液 离心收集细胞,每5-10×106动物、植物、酵母细胞或1×107细菌细胞加入1ml TRIzol,反复吸打。加TRIzol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。产品仅用于科研
2.将匀浆样品在室温(15-30℃)放置5分钟,使核酸蛋白复合物完全分离。
3.可选步骤:如样品中含有较多蛋白质,脂肪,多糖或胞外物质(肌肉,植物结节部分等)可于2-8℃10000×g离心10分钟,取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜,多糖,高分子量DNA,上清中含有RNA。处理脂肪组织时,上层有大量油脂应去除。取澄清的匀浆液进行下一步操作。
5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml,剧烈振荡15秒,室温放置3分钟。
6. 2-8℃10000×g离心15分钟。样品分为三层:底层为黄色有机相,上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中,水相体积约为所用TRIzol试剂的60℅。
7. 把水相转移到新管中,如要分离DNA和蛋白质可保留有机相,进一步操作见后。用异丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml异丙醇,室温放置10分钟。
8. 2-8℃10000×g离心10分钟,离心前看不出RNA沉淀,离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。

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