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分子生物学试剂 > DNA提取纯化 > RNase A(来源于牛胰腺)
产品名称:
RNase A(来源于牛胰腺)
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CS-01F96572
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RNase A(来源于牛胰腺)现货供应,价格实惠。
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一、概述:

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RNase A(来源于牛胰腺)

Ribonuclease A from bovine pancreas

100mg|1g

CS-01F96572

RNase A一种含4个二硫键的单链多肽,分子量约为13.7kDa(氨基酸序列)。作为一种核糖核酸内切酶(endoribonuclease),特异性降解单链RNA上的胞(C)或(U)残基。具体来说,切割识别的是由某核苷酸上的5-核糖和相邻的类核苷酸3-核糖上磷酸基团形成的磷酸二酯键,从而使得2,3-环磷酸水解为对应的3-核苷磷酸(比如,pG-pG-pC-pA-pGRNase A切割产生pG-pG-pCpA-PG)。

RNase A切割单链RNA活性高,推荐工作浓度为1-100μg/mL,兼容于各种反应体系。低盐浓度(0-100mM NaCl),可用来切割单链RNA,双链RNA,以及RNA-DNA杂交形成的RNA链。然而,高盐浓度(≥0.3M),RNase A仅特异性切割单链RNA

RNase A常见的应用在于质粒DNA或基因组DNA制备过程中去除RNA,此制备过程中DNase酶活性的存在与否是需要重视的污染之一,可采用水浴煮沸这种传统方法来灭活DNase活性。另外,本品还可用于RNA酶保护分析、RNA序列分析等分子生物学实验。

贮存液制备:

此为RNase A储存液配制的常用方法之一,也可以根据实验室传统的方法,或者参考文献资料使用其他方法制备储存液(如直接溶于10mM Tris-Cl,pH7.5或者Tris-NaCl溶液)。

1.利用10mM的醋酸钠(pH5.2)制备10mg/mLRNase A贮存液;

2100℃加热15min

3.冷却到室温,加入1/10体积的1M Tris-HClpH7.4),调其pH7.4(如:5mL 10mg/mLRNase储存液加入500μL 1M Tris-HCl,pH7.4);

4.分装于-20℃冻存,可稳定保存长达2年。

 

注意:在中性条件下煮沸RNase A溶液,会有RNase沉淀形成;在更低的pH下将其煮沸,如有沉淀可以观察到,可能由于蛋白杂质存在造成。煮沸之后若发现沉淀,可通过高速离心(13,000rpm)去除杂质,然后分装冻存。

实验步骤:
(1)实验开始前将RNA提取液于65℃水浴锅中预热,离心管中加入ME(巯基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)
(2)取约0.8g菌丝体(液体培养获得的菌丝用真空抽滤即可!固体培养就更好说了),在液氮中迅速磨成精细粉末,装入50mL离心管,按1g材料8mL的量加入预热的RNA提取液,颠倒混匀  
(3)65℃水浴3-10 min,期间混匀2-3次
(4)加入等体积的酚(注意是酸酚pH4.5)::异戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(5)取上清,等体积的:异戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(6)加入1/4V体积10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或过夜)
(7)10,000rpm,4℃离心20min
(8)弃上清,用500ul SSTE溶解沉淀
(9)酚::异戊醇(25:24:1)抽提两次,:异戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)
(10)加2V体积的无水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上
(11)12,000rpm,4℃离心20 min
(12)弃上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥
(13)加200ul的DEPC处理水溶解
(14)用非变性琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计扫描检测RNA的质量
(在抽提过程中,若蛋白质含量或其它的杂质还较多,可以增加抽提次数)
操作步骤:
1. 匀浆处理:a.组织 将组织在液氮中磨碎,每50-100mg组织加入1ml TRIzol,用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过TRIzol体积10℅。
b.单层培养细胞 直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞,每10cm2面积(即3.5cm直径的培养板)加1ml,用移液器吸打几次。TRIzol的用量应根据培养板面积而定,不取决于细胞数。TRIzol加量不足可能导致提取的RNA有DNA污染。
c.细胞悬液 离心收集细胞,每5-10×106动物、植物、酵母细胞或1×107细菌细胞加入1ml TRIzol,反复吸打。加TRIzol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。产品仅用于科研
2.将匀浆样品在室温(15-30℃)放置5分钟,使核酸蛋白复合物完全分离。
3.可选步骤:如样品中含有较多蛋白质,脂肪,多糖或胞外物质(肌肉,植物结节部分等)可于2-8℃10000×g离心10分钟,取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜,多糖,高分子量DNA,上清中含有RNA。处理脂肪组织时,上层有大量油脂应去除。取澄清的匀浆液进行下一步操作。
5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml,剧烈振荡15秒,室温放置3分钟。
6. 2-8℃10000×g离心15分钟。样品分为三层:底层为黄色有机相,上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中,水相体积约为所用TRIzol试剂的60℅。
7. 把水相转移到新管中,如要分离DNA和蛋白质可保留有机相,进一步操作见后。用异丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml异丙醇,室温放置10分钟。
8. 2-8℃10000×g离心10分钟,离心前看不出RNA沉淀,离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。

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