RNase A(来源于牛胰腺)CS-01F96572_上海莼试生物技术有限公司

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一、概述：

产品属性：

产品名称	英文名称	规格	货号
RNase A(来源于牛胰腺)	Ribonuclease A from bovine pancreas	100mg\|1g	CS-01F96572

RNase A一种含4个二硫键的单链多肽，分子量约为13.7kDa（氨基酸序列）。作为一种核糖核酸内切酶（endoribonuclease），特异性降解单链RNA上的胞（C）或（U）残基。具体来说，切割识别的是由某核苷酸上的5’-核糖和相邻的类核苷酸3’-核糖上磷酸基团形成的磷酸二酯键，从而使得2’,3’-环磷酸水解为对应的3’-核苷磷酸（比如，pG-pG-pC-pA-pG经RNase A切割产生pG-pG-pCp和A-PG）。

RNase A切割单链RNA活性高，推荐工作浓度为1-100μg/mL，兼容于各种反应体系。低盐浓度（0-100mM NaCl），可用来切割单链RNA，双链RNA，以及RNA-DNA杂交形成的RNA链。然而，高盐浓度（≥0.3M），RNase A仅特异性切割单链RNA。

RNase A常见的应用在于质粒DNA或基因组DNA制备过程中去除RNA，此制备过程中DNase酶活性的存在与否是需要重视的污染之一，可采用水浴煮沸这种传统方法来灭活DNase活性。另外，本品还可用于RNA酶保护分析、RNA序列分析等分子生物学实验。

贮存液制备：

此为RNase A储存液配制的常用方法之一，也可以根据实验室传统的方法，或者参考文献资料使用其他方法制备储存液（如直接溶于10mM Tris-Cl,pH7.5或者Tris-NaCl溶液）。

1．利用10mM的醋酸钠（pH5.2）制备10mg/mL的RNase A贮存液；

2．100℃加热15min；

3．冷却到室温，加入1/10体积的1M Tris-HCl（pH7.4），调其pH至7.4（如：5mL 10mg/mL的RNase储存液加入500μL 1M Tris-HCl,pH7.4）；

4．分装于-20℃冻存，可稳定保存长达2年。

注意：在中性条件下煮沸RNase A溶液，会有RNase沉淀形成；在更低的pH下将其煮沸，如有沉淀可以观察到，可能由于蛋白杂质存在造成。煮沸之后若发现沉淀，可通过高速离心（13,000rpm）去除杂质，然后分装冻存。

实验步骤：

(1)实验开始前将RNA提取液于65℃水浴锅中预热,离心管中加入ME(巯基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取约0.8g菌丝体(液体培养获得的菌丝用真空抽滤即可！固体培养就更好说了),在液氮中迅速磨成精细粉末,装入50mL离心管,按1g材料8mL的量加入预热的RNA提取液,颠倒混匀

(3)65℃水浴3-10 min,期间混匀2-3次

(4)加入等体积的酚(注意是酸酚pH4.5)::异戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等体积的:异戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V体积10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或过夜)

(7)10,000rpm,4℃离心20min

(8)弃上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::异戊醇(25:24:1)抽提两次,:异戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V体积的无水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃离心20 min

(12)弃上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC处理水溶解

(14)用非变性琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计扫描检测RNA的质量

(在抽提过程中,若蛋白质含量或其它的杂质还较多,可以增加抽提次数)

操作步骤:

1. 匀浆处理:a.组织将组织在液氮中磨碎,每50-100mg组织加入1ml TRIzol,用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过TRIzol体积10℅。

b.单层培养细胞直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞，每10cm2面积(即3.5cm直径的培养板)加1ml，用移液器吸打几次。TRIzol的用量应根据培养板面积而定，不取决于细胞数。TRIzol加量不足可能导致提取的RNA有DNA污染。

c．细胞悬液离心收集细胞，每5-10×106动物、植物、酵母细胞或1×107细菌细胞加入1ml TRIzol，反复吸打。加TRIzol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。产品仅用于科研

2．将匀浆样品在室温（15-30℃）放置5分钟，使核酸蛋白复合物完全分离。

3．可选步骤：如样品中含有较多蛋白质，脂肪，多糖或胞外物质（肌肉，植物结节部分等）可于2-8℃10000×g离心10分钟，取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。处理脂肪组织时，上层有大量油脂应去除。取澄清的匀浆液进行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，剧烈振荡15秒，室温放置3分钟。

6. 2-8℃10000×g离心15分钟。样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIzol试剂的60℅。

7. 把水相转移到新管中，如要分离DNA和蛋白质可保留有机相，进一步操作见后。用异丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml异丙醇，室温放置10分钟。

8. 2-8℃10000×g离心10分钟，离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。

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