注意事项：

溶液YP1在使用前先加入RNaseA(将试剂盒中提供的RNaseA全部加入)，混匀，置于2～8℃保存。

次使用前应按照试剂瓶标签的说明在漂洗液中加入无水乙醇配制成工作液(向15mL的漂洗液中加入60mL的无水乙醇)。

使用前请先检查溶液YP2和溶液YP3是否出现混浊，如有混浊现象，可在37℃水浴中加热几分钟，待溶液恢复澄清后再使用。

溶液YP2、溶液YP3和漂洗液使用后应立即盖紧盖子，如非指明，所有离心步骤均为使用台式离心机室温下进行离心。

质粒得率与酵母菌株、质粒拷贝数、培养条件等因素有关。通常酵母质粒拷贝数都很低，因此质粒得率一般为每5mL菌液提取1μg左右。

洗脱缓冲液的体积好不少于50μL，体积过小会影响回收效率；洗脱液的pH值对洗脱效率也有影响，若需要用水做洗脱液应保证其pH值在8.0左右(可用NaOH将水的pH值调至此范围)，pH值低于7.0会降低洗脱效率。

操作步骤：

取1～5mL酵母培养物（不过5×107cells），12000rpm离心1min，尽量吸除上清（菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中）。

酵母细胞壁的破除：

酶法：向酵母菌体中加入470μLBuffer，充分悬浮菌体，加入25μL酵母破壁酶和5μL巯基还原剂，充分混匀，30℃处理1-2h，期间可颠倒离心管混匀数次。12000rpm离心1min，弃上清，收集沉淀。向沉淀中加入250μL YP1（请先检查是否已加入RNaseA），充分悬浮沉淀。

注意：如果菌块未彻底混匀，会影响裂解导致质粒提取量和纯度偏低。

玻璃珠法：向酵母菌体中加入250μL YP 1（请先检查是否已加入RNaseA），充分悬浮沉淀。加入150～200μL酸洗玻璃珠（自备），漩涡振荡10min。简短离心使玻璃珠沉降到离心管底，吸取上清（如上清有所损失，请用YP 1补足至250μL）于另一干净离心管中。

向离心管中加入250μL YP2，温和地上下翻转6～8次使菌体充分裂解。

注意：混匀一定要温和，以免污染细菌基因组DNA，此时菌液应变得清亮粘稠，作用时间不要过5min，以免质粒受到破坏。

向离心管中加入350μL YP3，立即温和地上下翻转6～8次，充分混匀，此时会出现白色絮状沉淀。12000rpm离心10min，用移液器小心地将上清转移到另一个干净的离心管中，尽量不要吸出沉淀。

注意：YP3加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清。

将上一步所得上清液加入吸附柱中，室温放置2min，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

向吸附柱中加入600μL漂洗液(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放入收集管中。

向吸附柱中加入600μL漂洗液，12000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放入收集管中。

12000rpm离心2min，将吸附柱敞口置于室温或50℃温箱放置数分钟，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，否则漂洗液中的乙醇会影响后续的实验如酶切、PCR等。

将吸附柱放入一个干净的离心管中，向吸附膜中央悬空滴加50～200μL经65℃水浴预热的洗脱液，室温放置2min，12000rpm离心1min。

为了增加质粒的回收效率，可将得到的洗脱液重新加入吸附柱中，室温放置2min，12000rpm离心1min。