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分子生物学试剂 > DNA提取纯化 > 去内毒素质粒小量提取试剂盒(1~5mL)
产品名称:
去内毒素质粒小量提取试剂盒(1~5mL)
型号:
CS-01F96562
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去内毒素质粒小量提取试剂盒(1~5mL)现货供应,价格实惠。
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一、概述:

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去内毒素质粒小量提取试剂盒(15mL)

Free Endotoxin Plasmid DNA Extraction Mini Kit(1-5mL)

50T|100T

CS-01F96562

本试剂盒采用碱裂解法裂解细胞,根据离心吸附柱在高盐状态下特异性地结合溶液中的DNA的原理特异性提取质粒DNA。离心吸附柱中采用的硅基质材料能高效、专一地吸附DNA,可大限度去除杂质蛋白及细胞中其他有机化合物。研制的内毒素清除剂,可大限度地除去内毒素。从15mL大肠杆菌LB培养液中,可快速提取515μg高纯度质粒DNA,提取率达8590%。使用本试剂盒提取的质粒DNA纯度高,可直接用于细胞转染等要求较高的实验,以及其他各种常规操作,包括酶切、PCR、测序、连接和转化等试验。

保存:常温干燥保存,复检期为一年。

注意:

使用前请先在漂洗液中加入无水乙醇,加入体积请参照瓶体上的标签。溶液P1在使用前先将试剂盒中提供的RNase A全部加入,混匀,置于28℃保存。如非指明,所有离心步骤均为使用台式离心机在室温下离心。

操作步骤:

15mL细菌培养物,12000rpm离心1min,吸除上清(菌液浓度较低时可多次离心收集到一个离心管中)。

向留有菌体沉淀的离心管中加入200μL溶液P1(请先检查是否已加入RNase A),使用移液器或旋涡振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀。

注意:如果菌块未彻底混匀,会影响裂解导致质粒提取量和纯度偏低。

向离心管中加入200μL溶液P2,温和地上下翻转68次使菌体充分裂解。

注意:混匀一定要温和,以免污染细菌基因组DNA,此时菌液应变得清亮粘稠,作用时间不要过5min,以免质粒受到破坏。

向离心管中加入200μL溶液P3,立即温和地上下翻转68次,充分混匀,此时会出现白色絮状沉淀。12000rpm 离心10min,用移液器小心地将上清转移到另一个干净的离心管中,尽量不要吸出沉淀。

注意:溶液P3加入后应立即混合,避免产生局部沉淀。如果上清中还有微小白色沉淀,可再次离心后取上清。

加入上清1/5体积的冰上预冷的内毒素清除剂,振荡混匀,溶液变浑浊,冰浴2min至溶液变清亮。

37℃水浴5min,不时振荡,溶液又变浑浊。12000rpm室温离心5min,溶液应分为两相,上层水相含质粒DNA,下层油相含内毒素。

将含质粒DNA的上层水相转移至新管,弃下层油相,注意不要吸入油状相。重复步骤57三次。

加入600μL的溶液P4,充分混匀后加入吸附柱中,室温放置2min12000rpm离心1min,倒掉收集管中的废液,将吸附柱重新放回收集管中。如果溶液量多可分多次加入。

向吸附柱中加入600μL漂洗液(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)12000rpm离心1min,弃废液,将吸附柱放入收集管中。

向吸附柱中加入600μL漂洗液,12000rpm离心1min,弃废液,将吸附柱放入收集管中。

12000rpm离心2min,将吸附柱敞口置于室温或50℃温箱放置数分钟,目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除,否则漂洗液中的乙醇会影响后续的实验如酶切、PCR等。

将吸附柱放入一个干净的离心管中,向吸附膜中央悬空滴加50200μL65℃水浴预热的洗脱液,室温放置2min12000rpm离心1min

 

为了增加质粒的回收效率,可将得到的洗脱液重新加入吸附柱中,室温放置2min12000rpm离心1min

实验步骤:
(1)实验开始前将RNA提取液于65℃水浴锅中预热,离心管中加入ME(巯基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)
(2)取约0.8g菌丝体(液体培养获得的菌丝用真空抽滤即可!固体培养就更好说了),在液氮中迅速磨成精细粉末,装入50mL离心管,按1g材料8mL的量加入预热的RNA提取液,颠倒混匀  
(3)65℃水浴3-10 min,期间混匀2-3次
(4)加入等体积的酚(注意是酸酚pH4.5)::异戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(5)取上清,等体积的:异戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(6)加入1/4V体积10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或过夜)
(7)10,000rpm,4℃离心20min
(8)弃上清,用500ul SSTE溶解沉淀
(9)酚::异戊醇(25:24:1)抽提两次,:异戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)
(10)加2V体积的无水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上
(11)12,000rpm,4℃离心20 min
(12)弃上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥
(13)加200ul的DEPC处理水溶解
(14)用非变性琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计扫描检测RNA的质量
(在抽提过程中,若蛋白质含量或其它的杂质还较多,可以增加抽提次数)
操作步骤:
1. 匀浆处理:a.组织 将组织在液氮中磨碎,每50-100mg组织加入1ml TRIzol,用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过TRIzol体积10℅。
b.单层培养细胞 直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞,每10cm2面积(即3.5cm直径的培养板)加1ml,用移液器吸打几次。TRIzol的用量应根据培养板面积而定,不取决于细胞数。TRIzol加量不足可能导致提取的RNA有DNA污染。
c.细胞悬液 离心收集细胞,每5-10×106动物、植物、酵母细胞或1×107细菌细胞加入1ml TRIzol,反复吸打。加TRIzol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。产品仅用于科研
2.将匀浆样品在室温(15-30℃)放置5分钟,使核酸蛋白复合物完全分离。
3.可选步骤:如样品中含有较多蛋白质,脂肪,多糖或胞外物质(肌肉,植物结节部分等)可于2-8℃10000×g离心10分钟,取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜,多糖,高分子量DNA,上清中含有RNA。处理脂肪组织时,上层有大量油脂应去除。取澄清的匀浆液进行下一步操作。
5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml,剧烈振荡15秒,室温放置3分钟。
6. 2-8℃10000×g离心15分钟。样品分为三层:底层为黄色有机相,上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中,水相体积约为所用TRIzol试剂的60℅。
7. 把水相转移到新管中,如要分离DNA和蛋白质可保留有机相,进一步操作见后。用异丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml异丙醇,室温放置10分钟。
8. 2-8℃10000×g离心10分钟,离心前看不出RNA沉淀,离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。

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