产品属性:
产品名称 | 英文名称 | 规格 | 货号 |
去内毒素质粒小量提取试剂盒(1~5mL) | Free Endotoxin Plasmid DNA Extraction Mini Kit(1-5mL) | 50T|100T | CS-01F96562 |
本试剂盒采用碱裂解法裂解细胞,根据离心吸附柱在高盐状态下特异性地结合溶液中的DNA的原理特异性提取质粒DNA。离心吸附柱中采用的硅基质材料能高效、专一地吸附DNA,可大限度去除杂质蛋白及细胞中其他有机化合物。研制的内毒素清除剂,可大限度地除去内毒素。从1~5mL大肠杆菌LB培养液中,可快速提取5~15μg高纯度质粒DNA,提取率达85~90%。使用本试剂盒提取的质粒DNA纯度高,可直接用于细胞转染等要求较高的实验,以及其他各种常规操作,包括酶切、PCR、测序、连接和转化等试验。
保存:常温干燥保存,复检期为一年。
注意:
使用前请先在漂洗液中加入无水乙醇,加入体积请参照瓶体上的标签。溶液P1在使用前先将试剂盒中提供的RNase A全部加入,混匀,置于2~8℃保存。如非指明,所有离心步骤均为使用台式离心机在室温下离心。 操作步骤: 取1~5mL细菌培养物,12000rpm离心1min,吸除上清(菌液浓度较低时可多次离心收集到一个离心管中)。 向留有菌体沉淀的离心管中加入200μL溶液P1(请先检查是否已加入RNase A),使用移液器或旋涡振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀。 注意:如果菌块未彻底混匀,会影响裂解导致质粒提取量和纯度偏低。 向离心管中加入200μL溶液P2,温和地上下翻转6~8次使菌体充分裂解。 注意:混匀一定要温和,以免污染细菌基因组DNA,此时菌液应变得清亮粘稠,作用时间不要过5min,以免质粒受到破坏。 向离心管中加入200μL溶液P3,立即温和地上下翻转6~8次,充分混匀,此时会出现白色絮状沉淀。12000rpm 离心10min,用移液器小心地将上清转移到另一个干净的离心管中,尽量不要吸出沉淀。 注意:溶液P3加入后应立即混合,避免产生局部沉淀。如果上清中还有微小白色沉淀,可再次离心后取上清。 加入上清1/5体积的冰上预冷的内毒素清除剂,振荡混匀,溶液变浑浊,冰浴2min至溶液变清亮。 37℃水浴5min,不时振荡,溶液又变浑浊。12000rpm室温离心5min,溶液应分为两相,上层水相含质粒DNA,下层油相含内毒素。 将含质粒DNA的上层水相转移至新管,弃下层油相,注意不要吸入油状相。重复步骤5~7三次。 加入600μL的溶液P4,充分混匀后加入吸附柱中,室温放置2min,12000rpm离心1min,倒掉收集管中的废液,将吸附柱重新放回收集管中。如果溶液量多可分多次加入。 向吸附柱中加入600μL漂洗液(使用前请先检查是否已加入无水乙醇),12000rpm离心1min,弃废液,将吸附柱放入收集管中。 向吸附柱中加入600μL漂洗液,12000rpm离心1min,弃废液,将吸附柱放入收集管中。 12000rpm离心2min,将吸附柱敞口置于室温或50℃温箱放置数分钟,目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除,否则漂洗液中的乙醇会影响后续的实验如酶切、PCR等。 将吸附柱放入一个干净的离心管中,向吸附膜中央悬空滴加50~200μL经65℃水浴预热的洗脱液,室温放置2min,12000rpm离心1min。
为了增加质粒的回收效率,可将得到的洗脱液重新加入吸附柱中,室温放置2min,12000rpm离心1min。 |
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