细胞凋亡DNA Ladder提取试剂盒CS-01F96541_上海莼试生物技术有限公司

产品详情

一、概述：

产品属性：

产品名称	英文名称	规格	货号
细胞凋亡DNA Ladder提取试剂盒	Cells Apoptosis DNA Ladder Extraction Kit	20次\|50次	CS-01F96541

本试剂盒适用于快速提取凋亡DNA Ladder。细胞发生凋亡时，染色质DNA在核小体之间发生断裂，终形成200bp整数倍的DNA片段，这些DNA片段被提取后，经电泳及溴化乙锭染色后形成梯子状外观，谓之DNA Ladder。血液和组织培养细胞在裂解/结合液中裂解后，释放出来的DNA片段在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜，再通过一系列快速的漂洗－离心的步骤，将盐、细胞代谢物、蛋白等杂质去除，后低盐的洗脱缓冲液将DNA Ladder片段从硅基质膜上洗脱。

试剂盒组份(50次)：

裂解/结合液CB————————15 ml

漂洗液WB——————————15 ml

洗脱缓冲液EB————————15 ml

吸附柱AC——————————50个

收集管(2ml)—————————50个

产品特点：

1.不需要使用有毒的等试剂，也不需要乙醇沉淀等步骤。

2.本公司独特的裂解/结合液配方有效裂解细胞，使用本试剂盒不需要加入昂贵的蛋白酶K处理，大大降低了使用成本和加快了处理速度。

3.节省时间，简捷，单个样品操作一般可在10分钟内完成。

注意事项

1. 所有的离心步骤均在室温完成，使用转速可以达到13,000rpm的传统台式离心机，如Eppendorf 5415C 或者类似离心机。

2. 开始实验前将需要的水浴先预热到70℃备用。

3. 裂解/结合液CB 含有刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套，避免沾染皮肤，眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时，要用大量清水或者生理盐水冲洗。

4. 一般2×106 培养细胞DNA 产量为10-20μg， 200μl 人全血典型产量为3-6μg。

5. 一般电泳检测时典型上样量为2-3μg 纯化的DNA，如果凋亡率低，有可能只见到基因组DNA，而见不到DNA ladder，可以试试加大上样量。

储存条件：室温，有效期12个月。

本制品别名：凋亡DNA Ladder快速提取试剂盒

实验步骤：

(1)实验开始前将RNA提取液于65℃水浴锅中预热,离心管中加入ME(巯基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取约0.8g菌丝体(液体培养获得的菌丝用真空抽滤即可！固体培养就更好说了),在液氮中迅速磨成精细粉末,装入50mL离心管,按1g材料8mL的量加入预热的RNA提取液,颠倒混匀

(3)65℃水浴3-10 min,期间混匀2-3次

(4)加入等体积的酚(注意是酸酚pH4.5)::异戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等体积的:异戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V体积10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或过夜)

(7)10,000rpm,4℃离心20min

(8)弃上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::异戊醇(25:24:1)抽提两次,:异戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V体积的无水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃离心20 min

(12)弃上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC处理水溶解

(14)用非变性琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计扫描检测RNA的质量

(在抽提过程中,若蛋白质含量或其它的杂质还较多,可以增加抽提次数)

操作步骤:

1. 匀浆处理:a.组织将组织在液氮中磨碎,每50-100mg组织加入1ml TRIzol,用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过TRIzol体积10℅。

b.单层培养细胞直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞，每10cm2面积(即3.5cm直径的培养板)加1ml，用移液器吸打几次。TRIzol的用量应根据培养板面积而定，不取决于细胞数。TRIzol加量不足可能导致提取的RNA有DNA污染。

c．细胞悬液离心收集细胞，每5-10×106动物、植物、酵母细胞或1×107细菌细胞加入1ml TRIzol，反复吸打。加TRIzol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。产品仅用于科研

2．将匀浆样品在室温（15-30℃）放置5分钟，使核酸蛋白复合物完全分离。

3．可选步骤：如样品中含有较多蛋白质，脂肪，多糖或胞外物质（肌肉，植物结节部分等）可于2-8℃10000×g离心10分钟，取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。处理脂肪组织时，上层有大量油脂应去除。取澄清的匀浆液进行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，剧烈振荡15秒，室温放置3分钟。

6. 2-8℃10000×g离心15分钟。样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIzol试剂的60℅。

7. 把水相转移到新管中，如要分离DNA和蛋白质可保留有机相，进一步操作见后。用异丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml异丙醇，室温放置10分钟。

8. 2-8℃10000×g离心10分钟，离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。

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