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分子生物学试剂 > DNA提取纯化 > 一步法质粒大提试剂盒(10~100mL)
产品名称:
一步法质粒大提试剂盒(10~100mL)
型号:
CS-01F96533
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产品简介
一步法质粒大提试剂盒(10~100mL)现货供应,价格实惠。
产品详情

一、概述:

产品属性:

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一步法质粒大提试剂盒(10100mL)

One-Step Plasmid Maxi Kit(10-100mL)

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CS-01F96533

本试剂盒是在我司一步法质粒(BTN70903)基础上开发的、能够快速从100mL左右的E.coli培养液中取质粒DNA的产品。它只需要一种溶液即可以完成细菌裂解,并且裂解物可以直接上柱纯化质粒DNA。它比经典的碱变性质粒制备方法更加快捷和方便。

试剂盒特点:

快速,整个质粒DNA提取过程只需要不到30分钟,比传统的碱变性方法快捷。

螺旋比例高,的非碱法一步式细菌裂解技术,避免了碱对DNA的损害,得到的质粒DNA切口更少。

DNA纯度高,几乎没有基因组DNARNA污染,OD260/280一般在1.71.9之间。

DNA可以直接用于电泳、酶切、PCR、细菌转化、分子克隆等实验。

大吸附量为600μg DNA,具体产率取决于质粒拷贝数。

过程简单,重复性和稳定性好。

保存条件:

常温运输及保存(溶液A需要4℃保存),有效期一年。

使用方法:

50mL离心管分数次收集1060mL新鲜的菌液,一般可以5000rpm

离心10分钟,去除上清即得细菌沉淀。

往细菌沉淀中加入14mL溶液A,充分振荡悬浮或吹打混匀。

注意:充分重悬细胞沉淀(无块状物)对于获得高的质粒产量十分重要。

将裂解液全部转移到大离心吸附柱中,放入到配套的收集管中。

6000rpm离心510分钟,弃穿透液。离心过滤柱将吸附溶液中的质粒DNA,而将基因组DNA和杂质在穿透液中。如果离心吸附柱中还有未离心下去的裂解液,可以适当延长离心时间直到离心吸附柱中没有残留液体。

10mL通用预洗液加入到离心吸附柱中,室温静置2分钟后6000rpm离心5分钟,弃穿透液。

重复上步一次。

10mL通用洗柱液加入到离心吸附柱中,室温静置2分钟后6000rpm离心5分钟,弃穿透液。

重复上步一次。

室温6000rpm空甩5分钟,弃穿透液。注意:此步很重要,不能跳过。

将离心吸附柱放入一个自备的、干净的50mL塑料离心管中,加1mL通用洗脱液(洗脱液如加热到5065℃效果更佳),室温静置2分钟后6000rpm离心5分钟,收集液即是质粒DNA溶液。

重复上步1次以便洗脱更多的质粒DNA

 

合并所得质粒DNA,立即使用或-20℃储存。

实验步骤:
(1)实验开始前将RNA提取液于65℃水浴锅中预热,离心管中加入ME(巯基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)
(2)取约0.8g菌丝体(液体培养获得的菌丝用真空抽滤即可!固体培养就更好说了),在液氮中迅速磨成精细粉末,装入50mL离心管,按1g材料8mL的量加入预热的RNA提取液,颠倒混匀  
(3)65℃水浴3-10 min,期间混匀2-3次
(4)加入等体积的酚(注意是酸酚pH4.5)::异戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(5)取上清,等体积的:异戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(6)加入1/4V体积10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或过夜)
(7)10,000rpm,4℃离心20min
(8)弃上清,用500ul SSTE溶解沉淀
(9)酚::异戊醇(25:24:1)抽提两次,:异戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)
(10)加2V体积的无水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上
(11)12,000rpm,4℃离心20 min
(12)弃上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥
(13)加200ul的DEPC处理水溶解
(14)用非变性琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计扫描检测RNA的质量
(在抽提过程中,若蛋白质含量或其它的杂质还较多,可以增加抽提次数)
操作步骤:
1. 匀浆处理:a.组织 将组织在液氮中磨碎,每50-100mg组织加入1ml TRIzol,用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过TRIzol体积10℅。
b.单层培养细胞 直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞,每10cm2面积(即3.5cm直径的培养板)加1ml,用移液器吸打几次。TRIzol的用量应根据培养板面积而定,不取决于细胞数。TRIzol加量不足可能导致提取的RNA有DNA污染。
c.细胞悬液 离心收集细胞,每5-10×106动物、植物、酵母细胞或1×107细菌细胞加入1ml TRIzol,反复吸打。加TRIzol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。产品仅用于科研
2.将匀浆样品在室温(15-30℃)放置5分钟,使核酸蛋白复合物完全分离。
3.可选步骤:如样品中含有较多蛋白质,脂肪,多糖或胞外物质(肌肉,植物结节部分等)可于2-8℃10000×g离心10分钟,取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜,多糖,高分子量DNA,上清中含有RNA。处理脂肪组织时,上层有大量油脂应去除。取澄清的匀浆液进行下一步操作。
5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml,剧烈振荡15秒,室温放置3分钟。
6. 2-8℃10000×g离心15分钟。样品分为三层:底层为黄色有机相,上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中,水相体积约为所用TRIzol试剂的60℅。
7. 把水相转移到新管中,如要分离DNA和蛋白质可保留有机相,进一步操作见后。用异丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml异丙醇,室温放置10分钟。
8. 2-8℃10000×g离心10分钟,离心前看不出RNA沉淀,离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。

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