上海莼试生物技术有限公司
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分子生物学试剂 > DNA提取纯化 > 内毒素清除试剂盒
产品名称:
内毒素清除试剂盒
型号:
CS-01F96527
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产品简介
内毒素清除试剂盒现货供应,价格实惠。
产品详情

一、概述:

产品属性:

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内毒素清除试剂盒

Endotoxin removing Kit

1.5mL

CS-01F96527

本试剂盒使用的是一类高效内毒素清除树脂,它以修饰过的B(PMB)为配体,进行特异性的内毒素清除。经此专用亲和介质纯化,样品终的内毒素水平可低于0.1 EU/mL

细菌内毒素(脂多糖,LPS)是革兰氏阴性细菌细胞壁的主要成分。人们在研究革兰氏阴性菌血症和内毒素血症的过程中,发现细菌内毒素在其中起着关键的作用,内毒素使机体免疫功能严重受损,进一步的发展可能引发脓毒性休克,弥散性血管内凝血,急性呼吸窘迫综合症,全身炎症反应综合症或致命性多器官功能衰竭。因此,内毒素的清除对于人类疾病治疗的注射型药品、生物制品等都是必须的,尤其对于基因药物、蛋白药物、单抗克隆药物、治疗性疫苗、小分子化学药物等生物制品的下游纯化处理来说就显得非常重要。

试剂盒特点:

1.高稳定性,高去除效率。

2.高结合力:> 2000,000 EU/mL

3. pH范围为5-10时,亲和介质对内毒素的清除率在92%以上;pH值在7-8时,清除效率高。

4. 无需恒流泵即可调节流速。

5. 重复使用 5次不会改变柱子效果。

6. 使用方便,试剂盒中提供无热原缓冲液,无热原收集管及无热原枪头等。

7.适合纯化对象为蛋白,多肽,抗体,多糖等。

8.可耐受试剂:20% DMSO20% 乙醇,20% 甘油;1 M 尿素,300mM咪唑; 0.05% 吐温-2010mM DTT等。

储存条件:常温运输,4℃保存,有效期一年。

使用方法:

1.样品处理:样品的pH值和离子度在内毒素去除的过程中起着重要作用。虽然结合内毒素的pH范围在6-9,但是7-8pH范围是纯化的佳范围。合适的离子浓度可以降低非特异性吸附,0.15-0.5 M NaCl的条件可以得到一个很好的去除效率和低的样品损失。所以,纯化之前可以使用处理过的氯化钠,0.1 M的氢氧化钠或0.1 M盐酸来调节离子度或pH值。

2.活化亲和介质:将预装柱置于铁架台,垂直固定,去除预装柱顶部的盖子,打开流速控制器,使保护液在重力作用下流干,加入5mL(预冷)再生缓冲液,调节流速控制器,保持流速在0.25mL/min(或者10/min),待再生缓冲液流干,再加入5mL 再生缓冲液,再重复操作两次,确保体系保持无热原(即内毒素)存在。即使是次使用也必须进行这一步操作。这步操作大约需要60分钟完成。

3. 平衡亲和介质:活化完毕后,加入6mL(预冷)平衡缓冲液,调节流速控制器,保持流速在0.5mL/min,流干平衡缓冲液,再按此操作重复两次。这步操作大约需要40分钟完成。

4.内毒素清除:将流速控制器关闭,使用无热原枪头将样品加入,打开控制器,控制流速不高于0.25mL/min,流出液体积达到1.5mL后,使用无热原接收管接受样品,样品流干后,再加入1.5mL-3.0mL(预冷)平衡缓冲液淋洗,收集淋洗液。检测样品浓度及内毒素水平。

5. 再次使用:如果流出样品内毒素水平未能达到预期值,需要将预装柱重新再生,按照步骤1 重新再生,然后上样纯化。

 

6. 储存条件:如果预装柱用完后需要保存,先用10mL 平衡缓冲液平衡柱子,待平衡液流干,加入1.5mL的再生缓冲液(0.02%的叠氮化钠)

实验步骤:
(1)实验开始前将RNA提取液于65℃水浴锅中预热,离心管中加入ME(巯基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)
(2)取约0.8g菌丝体(液体培养获得的菌丝用真空抽滤即可!固体培养就更好说了),在液氮中迅速磨成精细粉末,装入50mL离心管,按1g材料8mL的量加入预热的RNA提取液,颠倒混匀  
(3)65℃水浴3-10 min,期间混匀2-3次
(4)加入等体积的酚(注意是酸酚pH4.5)::异戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(5)取上清,等体积的:异戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(6)加入1/4V体积10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或过夜)
(7)10,000rpm,4℃离心20min
(8)弃上清,用500ul SSTE溶解沉淀
(9)酚::异戊醇(25:24:1)抽提两次,:异戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)
(10)加2V体积的无水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上
(11)12,000rpm,4℃离心20 min
(12)弃上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥
(13)加200ul的DEPC处理水溶解
(14)用非变性琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计扫描检测RNA的质量
(在抽提过程中,若蛋白质含量或其它的杂质还较多,可以增加抽提次数)
操作步骤:
1. 匀浆处理:a.组织 将组织在液氮中磨碎,每50-100mg组织加入1ml TRIzol,用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过TRIzol体积10℅。
b.单层培养细胞 直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞,每10cm2面积(即3.5cm直径的培养板)加1ml,用移液器吸打几次。TRIzol的用量应根据培养板面积而定,不取决于细胞数。TRIzol加量不足可能导致提取的RNA有DNA污染。
c.细胞悬液 离心收集细胞,每5-10×106动物、植物、酵母细胞或1×107细菌细胞加入1ml TRIzol,反复吸打。加TRIzol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。产品仅用于科研
2.将匀浆样品在室温(15-30℃)放置5分钟,使核酸蛋白复合物完全分离。
3.可选步骤:如样品中含有较多蛋白质,脂肪,多糖或胞外物质(肌肉,植物结节部分等)可于2-8℃10000×g离心10分钟,取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜,多糖,高分子量DNA,上清中含有RNA。处理脂肪组织时,上层有大量油脂应去除。取澄清的匀浆液进行下一步操作。
5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml,剧烈振荡15秒,室温放置3分钟。
6. 2-8℃10000×g离心15分钟。样品分为三层:底层为黄色有机相,上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中,水相体积约为所用TRIzol试剂的60℅。
7. 把水相转移到新管中,如要分离DNA和蛋白质可保留有机相,进一步操作见后。用异丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml异丙醇,室温放置10分钟。
8. 2-8℃10000×g离心10分钟,离心前看不出RNA沉淀,离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。

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