内毒素是质粒提取中常见的污染物，由于真核细胞对内毒素非常敏感，因此，如果质粒中含有内毒素会大大降低真核细胞转染效率。本试剂盒提供一种简单、快捷、高效提取无内毒素质粒的新方法，提取的质粒大限度去除内毒素，并能有效去除基因组DNA、RNA、蛋白等污染。

保存：室温(15～30℃)

自备试剂：无水乙醇、异丙醇。

实验前准备及重要注意事项：

所有组分可在干燥、室温(15～30℃)环境稳定保存1年，更长时间保存可置于2～8℃，加入RNase A的Buffer P1置于2～8℃可稳定保存6个月。

次使用前，将RNase A溶液全部加入到Buffer P1中，混匀，置于2～8℃保存，使用前需在室温中放置一段时间，恢复至室温后使用。

次使用前应按照试剂瓶标签的说明在Buffer PW中加入无水乙醇。

使用前请先检查Buffer P2和Buffer E3是否出现结晶或沉淀，如有结晶或沉淀现象，可在37℃水浴几分钟，即可恢复澄清。

注意不要直接接触Buffer P2和Buffer E3，使用后应立即盖紧盖子。

提取质粒的量和纯度与细菌培养浓度、菌株种类、质粒大小、质粒拷贝数等因素有关。

操作步骤：

取5～15mL过夜培养的菌液，加入离心管(自备)中，13000rpm(~16200×g)离心1分钟收集细菌，尽量吸弃全部上清。

向留有菌体沉淀的离心管中加入500μL Buffer P1(请先检查是否已加入RNase A)，使用移液器或涡旋振荡器充分混匀，悬浮细菌沉淀。

注意：如果菌块未彻底混匀，将会影响裂解效果，使提取量和纯度偏低。

向离心管中加入500μL Buffer P2，温和地上下颠倒混匀8～10次，使菌体充分裂解，室温放置3～5分钟。此时溶液应变得清亮粘稠。

注意：温和混匀，不要剧烈震荡，以免打断基因组DNA，造成提取的质粒中混有基因组DNA片段。如果溶液未变得清亮，提示可能菌量过大，裂解不彻底，应减少菌体量。

向离心管中加入500μL Buffer E3，立即上下颠倒混匀8～10次，此时出现白色絮状沉淀，室温放置5分钟。13000rpm离心5分钟，吸取上清，将上清加入过滤柱FM中(已装入收集管)，13000rpm离心1分钟过滤，将收集管中的滤液转移到离心管(自备)中。

注意：

① Buffer E3加入后应立即混匀，避免产生局部沉淀。

② 吸附柱的大容积为750μL，所以上清液请分两次过滤，并混合于同一自备离心管中。

向滤液中加入450μL异丙醇，上下颠倒混匀。

柱平衡：向已装入收集管的吸附柱中加入200μL Buffer PS，13000rpm离心2分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

将步骤5中滤液与异丙醇的混合溶液转移到平衡好的吸附柱(已装入收集管)中。

13000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

注意：吸附柱的大容积为750μL，所以第5步中所得溶液分多次过柱。

向吸附柱中加入750μL Buffer PW(请先检查是否已加入无水乙醇)，13000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液。

将吸附柱重新放回收集管中，13000rpm离心1分钟。

注意：这一步的目的是将吸附柱中残余的乙醇去除，乙醇的残留会影响后续的酶促反应(酶切、PCR等)。

将吸附柱置于一个新的离心管(自备)中，向吸附膜的中间部位加入100～200μL Endo-Free Buffer EB，室温放置2～5分钟，13000rpm离心2分钟。-20℃保存质粒。

注意：

① 为了增加质粒的回收效率，可将得到的溶液重新加入到吸附柱中，室温放置2～5分钟，13000rpm离心2分钟。Endo-Free Buffer EB在65～70℃水浴预热，适当延长吸附和洗脱的时间，可以增加提取效率。

② 质粒拷贝数较低或>10kb时，Endo-Free Buffer EB在65～70℃水浴预热，可以增加提取效率。