内毒素是质粒提取中常见的污染物，由于真核细胞对内毒素非常敏感，因此，如果质粒中含有内毒素会大大降低真核细胞转染效率。

保存：室温(15～30℃)

自备试剂：

无水乙醇、异丙醇。

实验前准备及重要注意事项：

所有组分可在干燥、室温（15～30℃）环境稳定保存1年，将吸附柱置于2～8℃可保存更长时间，加入RNase A的Buffer P1置于2～8℃可稳定保存6个月。

Buffer P1在使用前先加入RNase A（将试剂盒中提供的RNase A全部加入），混匀，置于2～8℃保存。使用前需在室温中放置一段时间，恢复至室温后使用。

次使用前应按照试剂瓶标签的说明在Buffer PW中加入无水乙醇。

使用前请先检查Buffer P2和Buffer E3是否出现结晶或沉淀，如有结晶或沉淀现象，可在37℃水浴几分钟，即可恢复澄清。

注意Buffer P2和Buffer E3含有刺激性物质，请戴手套操作，使用后应立即盖紧盖子。

使用Buffer PS处理过的吸附柱好立即使用，避免放置时间过长影响使用效果。

提取质粒的量和纯度与细菌培养浓度、菌株种类、质粒大小、质粒拷贝数等因素有关。

操作步骤：

取150mL过夜培养的菌液，加入离心管（自备）中，12000×g离心2～3分钟收集细菌，尽量吸弃全部上清。

向留有菌体沉淀的离心管中加入12mL Buffer P1（请先检查是否已加入RNase A）

使用移液器或涡旋振荡器充分混匀，悬浮细菌沉淀。

注意：如果菌块未彻底混匀，将会影响裂解效果，使提取量和纯度偏低。

向离心管中加入12mL Buffer P2，温和地上下颠倒混匀8～10次，使菌体充分裂解，室温放置3～5分钟。此时溶液应变得清亮粘稠。

注意：温和混匀，不要剧烈震荡，以免打断基因组DNA，造成提取的质粒中混有基因组DNA片段。如果溶液未变得清亮，提示可能菌量过大，裂解不彻底，应减少菌体量。

向离心管中加入12mL Buffer E3，立即上下颠倒混匀8～10次，此时出现白色絮状沉淀，室温放置5分钟。12000×g离心10分钟，将上清转移至干净离心管（自备）中，注意不要带入沉淀。

注意：Buffer E3加入后应立即混匀，避免产生局部沉淀。

加入0.3倍滤液体积的异丙醇，上下颠倒混匀。

注意：加入异丙醇过多容易导致RNA污染。

柱平衡：向已装入收集管中的吸附柱DQ中加入2mL Buffer PS，12000×g离心2分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

将步骤5中液体与异丙醇的混合溶液转移到平衡好的吸附柱DQ（已装入收集管）中。12000×g离心2分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

注意：吸附柱的大容积为15mL，所以第7步中所得溶液分多次过柱。如果离心机转子倾角较大时，建议加入吸附柱的溶液体积不过10mL，以防发生漏液现象。

向吸附柱中加入10mL Buffer PW（请先检查是否已加入无水乙醇），12000×g离心2分钟，倒掉收集管中的废液。

重复步骤8。

向吸附柱中加入10mL Endo-Free Buffer PW，12000×g离心2分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

将吸附柱重新放回收集管中，12000×g离心5分钟，倒掉废液，将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干吸附柱中残余的漂洗液。

注意：这一步的目的是将吸附柱中残余的乙醇去除，乙醇的残留会影响后续的酶促反应（酶切、PCR等）。

将吸附柱置于一个新的离心管中，向吸附膜的中间部位加入1～3mL Endo-Free Buffer EB，室温放置2～5分钟，12000×g离心5分钟，将质粒溶液收集到离心管中。-20℃保存质粒。

注意：

1）为了增加质粒的回收效率，可将得到的溶液重新加入到吸附柱中，室温放置2～5分钟，12000×g离心5分钟，将质粒溶液收集到离心管中。

2）质粒拷贝数较低或>10kb时，Endo-Free Buffer EB在65～70℃水浴预热，可以增加提取效率。