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柱式真菌DNA大量提取试剂盒(玻璃珠法)
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CS-01F96508
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柱式真菌DNA大量提取试剂盒(玻璃珠法)现货供应,价格实惠。
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一、概述:

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柱式真菌DNA大量提取试剂盒(玻璃珠法)

Fungus DNA Column large-scale extraction kit(Glass bead method)

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CS-01F96508

本试剂盒在柱式真菌(BTN70901)基础上改良而得大提升级产品,主要用于大量快速从各种真菌材料中提取基因组DNA

产品特点:

1.处理量大,一次可以处理1-3g 各种真菌组织。

2. 纯度高,OD260/280一般在1.8以上。不含污染和抑制剂,得到的DNA可以不经稀释直接用于酶切、PCRreal-timePCRmultiplex PCRRAPDRELPAFLPSouthern Blottingmicrosatellite analysis等各种后续分子生物学实验。

3. 采用玻璃珠法破碎细胞,属于物理方法,远比基于蜗牛酶或破壁酶的温和化学破壁法重复性好,也不容易带入外援真菌DNA

4.产率一般在10-100μg/g真菌样品。离心吸附柱大吸附量为800μg

5. DNA片段长度一般在20-40kb左右。

6.适用范围广,适用于度大多数真菌材料,包括酵母(S.cerevisiaeS.pombPichia pastoris)等。

储存条件:常温运输,4℃保存,有效期一年。

使用方法:

1. 对菌液:取60-100mL 过夜培养的真菌菌液(OD600一般在1以上)到干净的塑料离心管中,12000rpm离心2分钟弃上清留沉淀。

2. 对菌落:用接种针在在培养基上刮取尽可能多的真菌菌落(1 g),转移到装有20mL 无菌水的干净的塑料离心管中,洗涤下接种环上的菌体。12000rpm离心2分钟弃上清留沉淀。

3. 对孢子材料,一般取1-3g左右,直接加入到离心管中,在材料中加入无菌水20mL,振荡半分钟后12000rpm离心2分钟弃上清留沉淀。

4.沉淀中加入10mL溶液A10 克的玻璃珠,涡旋震荡10分钟,可以延长震荡时间。

5. 加入10mL的溶液B,涡旋震荡5分钟,12000rpm离心2分钟,将上清液全部转移到一个50mL的干净的塑料离心管中。

6.在上清中加入3倍体积的溶液C,颠倒数次混匀后,分三次上离心吸附柱,每次上柱后均先室温放置2分钟,然后12000rpm离心1分钟,倒掉穿透液,再次上柱,重复上面的操作,直到挂柱步骤完成。

7. 20mL 通用洗柱液加入离心柱,12000rpm离心1分钟,弃穿透液。

8. 重复上步操作一次。

9. 12000rpm 空甩1分钟去除残留液体。

10. 将离心柱放置在一新的50mL塑料离心管中,加入500μL DNA 洗脱液2.0

11.室温放置5分钟后12000rpm离心1分钟,管底即为真菌DNA样品,吸取离心管中的DNA溶液重新滴加在吸附柱上,离心洗脱以收集更多的DNA

12. 所得DNA可立即使用,也可长期保存在-20℃。

 

13. 注:如离心机转速不能达到12000rpm,可以用大转速离心10-15min 代替12000rpm离心1-2min

实验步骤:
(1)实验开始前将RNA提取液于65℃水浴锅中预热,离心管中加入ME(巯基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)
(2)取约0.8g菌丝体(液体培养获得的菌丝用真空抽滤即可!固体培养就更好说了),在液氮中迅速磨成精细粉末,装入50mL离心管,按1g材料8mL的量加入预热的RNA提取液,颠倒混匀  
(3)65℃水浴3-10 min,期间混匀2-3次
(4)加入等体积的酚(注意是酸酚pH4.5)::异戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(5)取上清,等体积的:异戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(6)加入1/4V体积10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或过夜)
(7)10,000rpm,4℃离心20min
(8)弃上清,用500ul SSTE溶解沉淀
(9)酚::异戊醇(25:24:1)抽提两次,:异戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)
(10)加2V体积的无水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上
(11)12,000rpm,4℃离心20 min
(12)弃上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥
(13)加200ul的DEPC处理水溶解
(14)用非变性琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计扫描检测RNA的质量
(在抽提过程中,若蛋白质含量或其它的杂质还较多,可以增加抽提次数)
操作步骤:
1. 匀浆处理:a.组织 将组织在液氮中磨碎,每50-100mg组织加入1ml TRIzol,用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过TRIzol体积10℅。
b.单层培养细胞 直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞,每10cm2面积(即3.5cm直径的培养板)加1ml,用移液器吸打几次。TRIzol的用量应根据培养板面积而定,不取决于细胞数。TRIzol加量不足可能导致提取的RNA有DNA污染。
c.细胞悬液 离心收集细胞,每5-10×106动物、植物、酵母细胞或1×107细菌细胞加入1ml TRIzol,反复吸打。加TRIzol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。产品仅用于科研
2.将匀浆样品在室温(15-30℃)放置5分钟,使核酸蛋白复合物完全分离。
3.可选步骤:如样品中含有较多蛋白质,脂肪,多糖或胞外物质(肌肉,植物结节部分等)可于2-8℃10000×g离心10分钟,取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜,多糖,高分子量DNA,上清中含有RNA。处理脂肪组织时,上层有大量油脂应去除。取澄清的匀浆液进行下一步操作。
5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml,剧烈振荡15秒,室温放置3分钟。
6. 2-8℃10000×g离心15分钟。样品分为三层:底层为黄色有机相,上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中,水相体积约为所用TRIzol试剂的60℅。
7. 把水相转移到新管中,如要分离DNA和蛋白质可保留有机相,进一步操作见后。用异丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml异丙醇,室温放置10分钟。
8. 2-8℃10000×g离心10分钟,离心前看不出RNA沉淀,离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。

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