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产品名称 | 英文名称 | 规格 | 货号 |
无内毒素质粒DNA小提试剂盒(1.5~5mL) | Endotoxin-free Plasmid Mini Kit(1.5-5mL) | 50次 | CS-01F96504 |
本试剂盒采用菌体内毒素清除剂,在质粒提取前就把细胞壁上的内毒素清除掉,彻底避免了目前通用的先提取DNA+内毒素混合物,再从中纯化质粒DNA的弊端。用本试剂盒提取的质粒DNA,内毒素的污染浓度低,适合于转染等对内毒素的污染敏感的实验。
试剂盒特点: 操作简单,只在经典的柱式质粒DNA提取前,增加菌体内毒素清除一步。 去内毒素效果好,处理一次可以去除99%以上的内毒素。 质粒丢失少,产率只比柱式质粒低5~10%,效果好于先提质粒DNA,再用液相内毒素清除剂处理的方法。 DNA可以直接用于转染等实验。 储存条件: 常温运输及保存,有效期一年。RNase A(10mg/mL)需要低温运输和保存。 使用方法: 一、用菌体内毒素清除剂清除E.coli细胞壁上的内毒素。 收集1.5~5mL E.coli饱和菌液,12000rpm离心1分钟,弃上清,得到细菌沉淀。 加入1mL菌体内毒素清除剂温和混匀后10000~12000rpm离心1分钟,弃上清(含内毒素)。 一次洗涤(1~2步)可以去掉90%以上的内毒素,如果需要,可以再重复上述洗涤操作步骤3次,得到的菌体可以直接进入后续的质粒DNA提取步骤。 二、从无内毒素的E.coli中提取质粒DNA 先将全部RNase A溶液全部加入到柱式质粒溶液A中,摇匀后再取用,未用完的柱式质粒溶液A好在4℃保存。 在第3步所得菌液中加入250μL柱式质粒溶液A,用枪头充分吹打使菌体重悬(此步在冰上操作效果更佳)。 注意:细胞未充分悬浮会影响后续操作,可以使用漩涡振荡器帮助混匀或使用Tip吸头吹打沉淀至完全混匀。 加入250μL柱式质粒溶液B(如果溶液B有沉淀,用前须37℃加热溶解后冷却到室温方可使用),温和反复颠倒混匀4~6次,看到溶液变粘即可,然后冰上放置不过4~5分钟。 注意:此步处理不能过5分钟,否则DNA的碱损伤比较严重。同时千万不要剧烈振荡,否则基因组DNA断裂产生的片段非常容易污染质粒DNA。溶液B用后需要将盖拧紧存放,否则空气中的二氧化碳会进入溶液,形成碳酸,中和溶液B中的NaOH,降低其效率)。 加入350μL冰上预冷的柱式质粒溶液C,反复颠倒混匀4~6次,可见白色沉淀物产生,然后冰上放置至少5分钟。 高转速(12000rpm以上)4℃离心5分钟,小心将上清液转移到离心吸附柱中。由于此时的溶液比重较大,有时候出现沉淀漂浮是正常现象,取上清时避开漂浮的沉淀即可。如果此步的离心在室温进行,更容易出现沉淀物漂浮的现象。 静置2分钟以让质粒DNA与吸附柱充分结合,此步十分重要。 室温12000rpm离心1分钟,弃收集管中的废液。 加入500μL的通用洗柱液,室温12000rpm离心1分钟,弃收集管中废液。 注意:通用洗柱液中含乙醇,用后需要将盖拧紧存放,否则乙醇会挥发。 重复上步1次。 室温12000rpm离心1分钟,甩干残留液体。此步不能省略,否则残留乙醇会影响DNA的后续使用(如DNA上样时不能沉淀到加样孔中)。 将离心吸附柱置于一个新的1.5mL塑料离心管(自备)中,加入30~100μL 65~80℃预热的DNA洗脱液2.0,室温放置2分钟。常温的DNA洗脱液2.0也可以用于洗脱,但产量稍微有所降低。 室温12000rpm离心1分钟,离心管底溶液即质粒DNA。
注:由于的吸附柱结合DNA能力较,如果再加适量DNA洗脱液2.0到离心吸附柱中,往往还能洗脱下很多质粒DNA(相当于次洗脱的20~30%),但注意不要使用上步得到的DNA洗脱液2.0来洗脱。 |
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