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rRNA去除试剂盒(人/小鼠/大鼠) | rRNA Depletion Kit | 6次|24次|96次 | CS-01F96450 |
本试剂盒采用特殊设计的DNA探针与核糖体RNA(rRNA)杂交,随后利用Ribo RNase H降解DNA-rRNA杂交链中的rRNA,从而去除人、小鼠、大鼠总RNA中的细胞质核糖体RNA(28S、18S、5.8S、5S)和线粒体内核糖体RNA(16S、12S),保留信使RNA(mRNA)和其它非编码RNA。
该试剂盒对于完整和部分降解的总RNA(如FFPE RNA)均具有良好的rRNA去除效果,所获得的去除了rRNA的RNA样本可用于mRNA和非编码RNA高通量测序,可显著提高测序结果中有效数据比例,纯化产物也可用于随机引物cDNA合成或其它下游应用。
产品特点: ·样本广泛:适用于高质量(完整)及部分降解(如FFPE)样本中rRNA的去除。 ·高效去除:有效去除95~99.9%的人/小鼠/大鼠的rRNA。 ·数据全面:保留了不完整mRNA和非编码RNA信息,使转录组数据更加全面。 ·快速评估:试剂盒中提供的引物可快速评估rRNA的去除效果。 储存条件:-20℃保存,保质期为一年,尽量避免反复冻融。 注意事项:请务必在使用本试剂盒之前阅读此注意事项。 1.操作过程请注意避免核酸样品和产物之间的交叉污染。 2.请使用不含RNA酶或DNA酶的枪头、离心管进行实验。 3.实验开始前,请清洁操作台,建议使用RNA酶及DNA酶清除试剂处理台面。确保没有RNA酶和DNA酶的污染。 |
实验步骤:
(1)实验开始前将RNA提取液于65℃水浴锅中预热,离心管中加入ME(巯基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)
(2)取约0.8g菌丝体(液体培养获得的菌丝用真空抽滤即可!固体培养就更好说了),在液氮中迅速磨成精细粉末,装入50mL离心管,按1g材料8mL的量加入预热的RNA提取液,颠倒混匀
(3)65℃水浴3-10 min,期间混匀2-3次
(4)加入等体积的酚(注意是酸酚pH4.5)::异戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(5)取上清,等体积的:异戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(6)加入1/4V体积10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或过夜)
(7)10,000rpm,4℃离心20min
(8)弃上清,用500ul SSTE溶解沉淀
(9)酚::异戊醇(25:24:1)抽提两次,:异戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)
(10)加2V体积的无水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上
(11)12,000rpm,4℃离心20 min
(12)弃上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥
(13)加200ul的DEPC处理水溶解
(14)用非变性琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计扫描检测RNA的质量
(在抽提过程中,若蛋白质含量或其它的杂质还较多,可以增加抽提次数)
操作步骤:
1. 匀浆处理:a.组织 将组织在液氮中磨碎,每50-100mg组织加入1ml TRIzol,用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过TRIzol体积10℅。
b.单层培养细胞 直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞,每10cm2面积(即3.5cm直径的培养板)加1ml,用移液器吸打几次。TRIzol的用量应根据培养板面积而定,不取决于细胞数。TRIzol加量不足可能导致提取的RNA有DNA污染。
c.细胞悬液 离心收集细胞,每5-10×106动物、植物、酵母细胞或1×107细菌细胞加入1ml TRIzol,反复吸打。加TRIzol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。
2.将匀浆样品在室温(15-30℃)放置5分钟,使核酸蛋白复合物完全分离。
3.可选步骤:如样品中含有较多蛋白质,脂肪,多糖或胞外物质(肌肉,植物结节部分等)可于2-8℃10000×g离心10分钟,取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜,多糖,高分子量DNA,上清中含有RNA。处理脂肪组织时,上层有大量油脂应去除。取澄清的匀浆液进行下一步操作。
5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml,剧烈振荡15秒,室温放置3分钟。
6. 2-8℃10000×g离心15分钟。样品分为三层:底层为黄色有机相,上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中,水相体积约为所用TRIzol试剂的60℅。
7. 把水相转移到新管中,如要分离DNA和蛋白质可保留有机相,进一步操作见后。用异丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml异丙醇,室温放置10分钟。
8. 2-8℃10000×g离心10分钟,离心前看不出RNA沉淀,离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。