上海莼试生物技术有限公司
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分子生物学试剂 > RNA提取纯化 > 快速核酸银染试剂盒
产品名称:
快速核酸银染试剂盒
型号:
CS-01F96409
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产品简介
快速核酸银染试剂盒现货供应,价格实惠。
产品详情

一、概述:

产品属性:

产品名称

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规格

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快速核酸银染试剂盒

Rapid Silver Stain Kit for Nucleic Acid

1000ml

CS-01F96409

分子生物学实验中,常利用银染的方法显示聚丙烯酰胺凝胶或者琼脂糖凝胶中的核酸条带,其检测原理是:银离子(Ag+)可与核酸形成稳定的复合物,随后Ag+ 在碱性环境下被还原剂如甲醛还原成银颗粒,后者通过显色可把核酸电泳条带染成黑褐色。该方法检测灵敏度比EB高达200倍,常用于检测SSR标记、SNP标记等。

常规的银染方法由固定、氧化、染色、显影、终止等若干个步骤组成,操作十分繁琐,尤其不适用于大批量实验。而本品的推出可大大改善上述问题,主要体现在:1)快速,整个过程仅需20分钟;2)操作简单,只有染色和显影两步;3)灵敏度跟常规方法相当,比EB200倍,能检测到10ngDNA条带。4)两个成分都是现用现配,可重复性好。

按照本方案提供的配制方法,共可配制试剂A和试剂B分别1000ml

产品组份:

组分名称 规格

试剂A 1 2g

试剂A 210×) 100ml

试剂A 310×) 100ml

试剂B 110×) 100ml

试剂B2 5ml

注意事项:

1)为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

2)银染主要出现在PAGE胶的表面,因此该方法更适合用于薄胶(0.5-0.75mm)的检测。

3)染色过程中,缓慢的振荡是必要的,一般选择40-60 rpm

4)凝胶表面的裂纹多是由于压力、手印及表面干燥所致,所以全程操作中都应带手套。

5PAGE凝胶背景呈均一的黑色多是水中的杂质引起的,所以溶液的配制应使用电导率小于1 μS的去离子水。

6 如果染色后有呈灰尘或烟雾状灰色或棕色的沉淀出现在凝胶表面,可能是几步漂洗过程不够彻底,或染色过程温度太低。

7)较深的银染背景多是丙烯酰胺中的杂质所致。

8)室温操作时,温度的波动往往会干扰银染的效果,恒温水浴可以解决这个问题。

9)染色使用的玻璃器皿必须非常干净,用酸浸泡可以满足要求。

10)银染应尽快照相,随着时间延长,蛋白条带会变浅,而背景会加深。

11)影响硝酸银染色效果的因素很多,其使用容器的材质也是一个非常重要的因素。通常玻璃平皿是理想的银染容器,其化学性质极其稳定,几乎不与银染试剂中的任何成分发生反应,且不具有吸附染料的特性。其次是医用搪瓷盘,瓷釉为无机玻璃质材料,能耐各种浓度的无机酸(包括氧化性酸)、有机酸、弱碱和有机溶剂,但不耐酸、碱介质交替使用,而常规银染法就是酸碱介质交替使用,因此搪瓷盘银染效果不如玻璃平皿。塑料种类较多,如果塑料是由含氨基官能团的有机物(脲、三聚氰胺或苯代三聚氰胺)与醛类(主要是甲醛)化合物经缩聚反应而得,则这种塑料会在碱性溶液中与有还原作用的甲醛发生反应,进而使甲醛消耗,减弱银离子与蛋白的结合,降低显色敏感度和显色速度。

实验步骤:
(1)实验开始前将RNA提取液于65℃水浴锅中预热,离心管中加入ME(巯基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)
(2)取约0.8g菌丝体(液体培养获得的菌丝用真空抽滤即可!固体培养就更好说了),在液氮中迅速磨成精细粉末,装入50mL离心管,按1g材料8mL的量加入预热的RNA提取液,颠倒混匀  
(3)65℃水浴3-10 min,期间混匀2-3次
(4)加入等体积的酚(注意是酸酚pH4.5)::异戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(5)取上清,等体积的:异戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(6)加入1/4V体积10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或过夜)
(7)10,000rpm,4℃离心20min
(8)弃上清,用500ul SSTE溶解沉淀
(9)酚::异戊醇(25:24:1)抽提两次,:异戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)
(10)加2V体积的无水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上
(11)12,000rpm,4℃离心20 min
(12)弃上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥
(13)加200ul的DEPC处理水溶解
(14)用非变性琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计扫描检测RNA的质量
(在抽提过程中,若蛋白质含量或其它的杂质还较多,可以增加抽提次数)
操作步骤:
1. 匀浆处理:a.组织 将组织在液氮中磨碎,每50-100mg组织加入1ml TRIzol,用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过TRIzol体积10℅。
b.单层培养细胞 直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞,每10cm2面积(即3.5cm直径的培养板)加1ml,用移液器吸打几次。TRIzol的用量应根据培养板面积而定,不取决于细胞数。TRIzol加量不足可能导致提取的RNA有DNA污染。
c.细胞悬液 离心收集细胞,每5-10×106动物、植物、酵母细胞或1×107细菌细胞加入1ml TRIzol,反复吸打。加TRIzol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。
2.将匀浆样品在室温(15-30℃)放置5分钟,使核酸蛋白复合物完全分离。
3.可选步骤:如样品中含有较多蛋白质,脂肪,多糖或胞外物质(肌肉,植物结节部分等)可于2-8℃10000×g离心10分钟,取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜,多糖,高分子量DNA,上清中含有RNA。处理脂肪组织时,上层有大量油脂应去除。取澄清的匀浆液进行下一步操作。
5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml,剧烈振荡15秒,室温放置3分钟。
6. 2-8℃10000×g离心15分钟。样品分为三层:底层为黄色有机相,上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中,水相体积约为所用TRIzol试剂的60℅。
7. 把水相转移到新管中,如要分离DNA和蛋白质可保留有机相,进一步操作见后。用异丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml异丙醇,室温放置10分钟。
8. 2-8℃10000×g离心10分钟,离心前看不出RNA沉淀,离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。

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