上海莼试生物技术有限公司
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产品名称:
全血microRNA提取试剂盒
型号:
CS-01F96403
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产品简介
全血microRNA提取试剂盒现货供应,价格实惠。
产品详情

一、概述:

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全血microRNA提取试剂盒

miR-Quant microRNA Extraction Kit From Blood

25T|100T

CS-01F96403

本试剂盒适用于冻存和新鲜的抗凝全血样本中提取血液中小RNA(200nt),具有操作步骤简单、重复性好、产率较高的特点。核酸提取的成功与否、提取质量的好坏对后续实验起着至关重要的作用。使用TRIzol试剂提取总RNA,对总RNA中包含的部分小RNA进行研究,该方法的缺点是总RNAmicroRNA的比例较小,同时由于mRNA的干扰,会导致后续反转录和RealTime PCR实验效率很低,很难获得理想的实验结果,且结果不可靠。在探索miRNA分子功能的过程中开发的全血miRNA提取试剂盒,通过一步上柱即可获得纯度高达98%的不含大RNAmiRNA,而且可在45分钟内完成小RNA的提取。每150μL全血可获得~1μgmicroRNA

保存:室温可保存2年。

注意:miRNA Reagent A溶液中含有胍盐,其具有烈的腐蚀性,试验时请务必佩戴防护眼镜、手套、口罩等防护措施,如有皮肤接触请立即用大量清水冲洗,再另行就医。

自备试剂:

异丙醇、乙醇、75%异丙醇

操作方法:

1.5mL EP管中加入300μL miRNA Reagent A。将150μL抗凝全血加入到上述300μL miRNA Reagent A中,立即手腕用力震荡混合均匀。室温静置5分钟以充分裂解细胞。

向上述裂解完毕的裂解液中加入250μL miRNA Reagent B,上下颠倒混合均匀。13000rpm离心5分钟,吸取550μL上清液,转移到新的1.5mL EP管中。

向上述溶液中加入200μL无水乙醇,手腕用力震荡数次,室温放置5分钟。

13000rpm离心10分钟,转移700μL上清液到新的1.5mlEP管中。

向上述溶液中加入300μL异丙醇,手腕用力上下颠倒数次。

分两次将上述溶液倒入到miRNA吸附柱中,13000rpm离心1分钟,倒掉过滤液。

向吸附柱中加入700μL 75%异丙醇洗涤一次,13000rpm离心1分钟,倒掉过滤液。

向吸附柱中加入500μL无水乙醇洗涤一次,13000rpm离心1分钟,倒掉过滤液。

吸附柱13000rpm空离心2分钟,去掉残留的乙醇。

将吸附柱放入到新1.5mL EP管中,室温放置2分钟,使残留乙醇挥发。在吸附柱滤芯上加入30μL RNase-Free TE Buffer,室温静置2分钟,13000rpm离心2分钟,洗脱产物即为提取的miRNA

实验步骤:
(1)实验开始前将RNA提取液于65℃水浴锅中预热,离心管中加入ME(巯基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)
(2)取约0.8g菌丝体(液体培养获得的菌丝用真空抽滤即可!固体培养就更好说了),在液氮中迅速磨成精细粉末,装入50mL离心管,按1g材料8mL的量加入预热的RNA提取液,颠倒混匀  
(3)65℃水浴3-10 min,期间混匀2-3次
(4)加入等体积的酚(注意是酸酚pH4.5)::异戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(5)取上清,等体积的:异戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(6)加入1/4V体积10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或过夜)
(7)10,000rpm,4℃离心20min
(8)弃上清,用500ul SSTE溶解沉淀
(9)酚::异戊醇(25:24:1)抽提两次,:异戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)
(10)加2V体积的无水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上
(11)12,000rpm,4℃离心20 min
(12)弃上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥
(13)加200ul的DEPC处理水溶解
(14)用非变性琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计扫描检测RNA的质量
(在抽提过程中,若蛋白质含量或其它的杂质还较多,可以增加抽提次数)
操作步骤:
1. 匀浆处理:a.组织 将组织在液氮中磨碎,每50-100mg组织加入1ml TRIzol,用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过TRIzol体积10℅。
b.单层培养细胞 直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞,每10cm2面积(即3.5cm直径的培养板)加1ml,用移液器吸打几次。TRIzol的用量应根据培养板面积而定,不取决于细胞数。TRIzol加量不足可能导致提取的RNA有DNA污染。
c.细胞悬液 离心收集细胞,每5-10×106动物、植物、酵母细胞或1×107细菌细胞加入1ml TRIzol,反复吸打。加TRIzol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。
2.将匀浆样品在室温(15-30℃)放置5分钟,使核酸蛋白复合物完全分离。
3.可选步骤:如样品中含有较多蛋白质,脂肪,多糖或胞外物质(肌肉,植物结节部分等)可于2-8℃10000×g离心10分钟,取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜,多糖,高分子量DNA,上清中含有RNA。处理脂肪组织时,上层有大量油脂应去除。取澄清的匀浆液进行下一步操作。
5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml,剧烈振荡15秒,室温放置3分钟。
6. 2-8℃10000×g离心15分钟。样品分为三层:底层为黄色有机相,上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中,水相体积约为所用TRIzol试剂的60℅。
7. 把水相转移到新管中,如要分离DNA和蛋白质可保留有机相,进一步操作见后。用异丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml异丙醇,室温放置10分钟。
8. 2-8℃10000×g离心10分钟,离心前看不出RNA沉淀,离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。

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