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分子生物学试剂 > RNA提取纯化 > 血清/血浆microRNA提取试剂盒
产品名称:
血清/血浆microRNA提取试剂盒
型号:
CS-01F96402
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血清/血浆microRNA提取试剂盒现货供应,价格实惠。
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一、概述:

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血清/血浆microRNA提取试剂盒

miR-Quant microRNA Extraction Kit From Blood

25T|100T

CS-01F96402

血清血浆中miRNA含量较组织细胞或外周血低,市面上现有的试剂盒提取血清血浆小RNA的得率普遍较低,因此很难用于后续的定量检测。

本试剂盒通过一步上柱即可获得高纯度miRNA,可在10min左右完成小RNA的提取,提取小RNA(<200nt)操作步骤简单、重复性好、小RNA产率高。

储存:室温可保存2年。

自备试剂:异丙醇、乙醇、75%异丙醇、2mL EP

注意:血清/血浆miRNA Reagent溶液中含有胍盐,其具有烈的腐蚀性,试验时请务必佩戴防护眼镜、手套、口罩等防护措施,如有皮肤接触请立即用大量清水冲洗,再另行就医。

操作方法:

(1)1.5mL EP管中加入800μL血清/血浆miRNA Reagent,再加入300μL血清或血浆样本,用腕力混匀30s,室温放置5min

(2) 13000rpm离心5min,将上清约1mL吸入到新的2mL EP管中。加入1mL异丙醇,上下颠倒混合均匀。

(3)将上述溶液分三次加至吸附柱中(每次约700μL),13000rpm离心15s,倒掉过柱液。

(4)向吸附柱中加入700μL 75%异丙醇洗涤一次,13000rpm离心15s,倒掉过滤液。

(5)向吸附柱中加入500μL无水乙醇洗涤一次,13000rpm离心15s,倒掉过滤液。

(6)吸附柱13000rpm空离心2min,去掉残留的乙醇。

(7)将吸附柱放入到新1.5mL EP管中,室温放置2min,使残留乙醇挥发。在吸附柱滤芯上加入30μL RNase-free H2O,室温静置2min13000rpm离心2min,洗脱产物即为提取的miRNA

实验步骤:
(1)实验开始前将RNA提取液于65℃水浴锅中预热,离心管中加入ME(巯基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)
(2)取约0.8g菌丝体(液体培养获得的菌丝用真空抽滤即可!固体培养就更好说了),在液氮中迅速磨成精细粉末,装入50mL离心管,按1g材料8mL的量加入预热的RNA提取液,颠倒混匀  
(3)65℃水浴3-10 min,期间混匀2-3次
(4)加入等体积的酚(注意是酸酚pH4.5)::异戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(5)取上清,等体积的:异戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(6)加入1/4V体积10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或过夜)
(7)10,000rpm,4℃离心20min
(8)弃上清,用500ul SSTE溶解沉淀
(9)酚::异戊醇(25:24:1)抽提两次,:异戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)
(10)加2V体积的无水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上
(11)12,000rpm,4℃离心20 min
(12)弃上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥
(13)加200ul的DEPC处理水溶解
(14)用非变性琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计扫描检测RNA的质量
(在抽提过程中,若蛋白质含量或其它的杂质还较多,可以增加抽提次数)
操作步骤:
1. 匀浆处理:a.组织 将组织在液氮中磨碎,每50-100mg组织加入1ml TRIzol,用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过TRIzol体积10℅。
b.单层培养细胞 直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞,每10cm2面积(即3.5cm直径的培养板)加1ml,用移液器吸打几次。TRIzol的用量应根据培养板面积而定,不取决于细胞数。TRIzol加量不足可能导致提取的RNA有DNA污染。
c.细胞悬液 离心收集细胞,每5-10×106动物、植物、酵母细胞或1×107细菌细胞加入1ml TRIzol,反复吸打。加TRIzol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。
2.将匀浆样品在室温(15-30℃)放置5分钟,使核酸蛋白复合物完全分离。
3.可选步骤:如样品中含有较多蛋白质,脂肪,多糖或胞外物质(肌肉,植物结节部分等)可于2-8℃10000×g离心10分钟,取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜,多糖,高分子量DNA,上清中含有RNA。处理脂肪组织时,上层有大量油脂应去除。取澄清的匀浆液进行下一步操作。
5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml,剧烈振荡15秒,室温放置3分钟。
6. 2-8℃10000×g离心15分钟。样品分为三层:底层为黄色有机相,上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中,水相体积约为所用TRIzol试剂的60℅。
7. 把水相转移到新管中,如要分离DNA和蛋白质可保留有机相,进一步操作见后。用异丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml异丙醇,室温放置10分钟。
8. 2-8℃10000×g离心10分钟,离心前看不出RNA沉淀,离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。

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