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产品名称 | 检测方法 | 规格 | 货号 |
蔗糖酶(sucrase)试剂盒 | 微量法 | 100管/48样 | CS-01S63828 |
注意:正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
蔗糖酶(EC
测定原理:
本试剂盒采用3.5-二硝基水杨酸法测定蔗糖酶催化产生的还原糖的含量,由此可得出蔗糖酶水解速度。其原理是3.5-二硝基水杨酸与还原糖共热被还原成棕红色的氨基化合物,在一定范围内还原糖的量和反应液的颜色深度成正比。此法操作简便、迅速、杂质干扰较小。
所需的仪器和用品:
可见分光光度计/酶标仪、沸水浴、移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。
试剂的组成和配制:
提取液:液体100mL×1瓶,4℃保存;
试剂一:液体2mL×1瓶,4℃保存;
试剂二:粉剂×1支 ,4℃保存,用时加入1mL蒸馏水充分溶解待用;用不完的试剂4℃保存;
试剂三:液体3mL×1瓶,常温保存;
样品测定的准备:
按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL提取液),进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
测定步骤:
1、分光光度计或酶标仪预热30min以上,调节波长至520nm,蒸馏水调零。
2、样本测定,(在EP管中依次加入下列试剂):
蔗糖酶活力计算:
a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下
1、标准条件下测定的回归方程为y = 0.1296x -0.12;x为标准品浓度(mg/mL),y为吸光值。
2、按照蛋白浓度计算
单位定义:每mg组织蛋白每分钟催化水解1μg蔗糖定义为一个酶活力单位。
蔗糖酶活力(μg/min/mg prot)=[1000×(ΔA+0.12)÷0.1296×V1]÷(V1×Cpr)÷T=771×(ΔA +0.12)÷Cpr。
3、按样本鲜重计算
单位定义:每g组织每分钟催化水解1μg蔗糖定义为一个酶活力单位。
蔗糖酶活力(μg/min/g鲜重)=[1000×(ΔA+0.12)÷0.1296×V1]÷(W×V1÷V2)÷T=771×(ΔA +0.12) ÷W。
1000:1mg/mL=1000μg/mL;V1:加入反应体系中样本体积,0.03mL;V2:加入提取液体积,1mL;T:反应时间,10min; Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本鲜重,g。
b.用96孔板测定的计算公式如下
1、标准条件下测定的回归方程为y = 0.0648x -0.12;x为标准品浓度(mg/mL),y为吸光值。
2、按照蛋白浓度计算
单位定义:每mg组织蛋白每分钟催化水解1μg 蔗糖定义为一个酶活力单位。
蔗糖酶活力(μg/min/mg prot)=[1000×(ΔA+0.12)÷0.0648×V1]÷(V1×Cpr)÷T=1542×(ΔA +0.12)÷Cpr。
3、按样本鲜重计算
单位的定义:每g组织每分钟催化水解1μg 蔗糖定义为一个酶活力单位。
蔗糖酶活力(μg/min/g鲜重)=[1000×(ΔA+0.12)÷0.0648×V1]÷(W×V1÷V2)÷T=1543×(ΔA +0.12) ÷W。
1000:1mg/mL=1000μg/mL;V1:加入反应体系中样本体积,0.03mL;V2:加入提取液体积,1mL;T:反应时间,10min; Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本鲜重,g。
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