漆酶（CE1.10.3.2）是一种含铜的多酚氧化酶，属于铜蓝氧化酶家族，广泛分布于真菌和高等植物中，具有较强的氧化还原能力，在纸浆生物漂白，环境污染物降解和木质纤维素降解以及生物检测方面有非常广泛的应用。

测定原理

漆酶分解底物ABTS产生ABTS自由基，在420nm处的吸光系数远大于底物ABTS，测定ABTS自由基的增加速率，可计算得漆酶活性。

自备实验用品及仪器

天平、低温离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、恒温水浴锅。

试剂组成和配制

提取液：液体100mL×1瓶，4℃保存。

试剂一：液体30mL×1瓶，4℃保存。

工作液：粉剂×1瓶，4℃避光保存，临用前加15mL试剂一溶解；用不完的试剂4℃保存一周。

酶液提取

1．组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。12000g 4℃离心30min，取上清，置冰上待测。

2．细胞：按照细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后4℃，10000g离心10min，取上清置于冰上待测。

3．细胞培养液：直接检测。

测定操作表

注意：

1、极少数样本在60℃水浴20min后会出现沉淀，可经过8000g 25℃离心10min后，取上清检测，例如成熟的水稻叶片样本。

2、为确保检测准确性，若ΔA大于1，将样本用提取液稀释2~10倍后重新检测，计算公式乘以相应稀释倍数。

酶活性计算公式

a．用微量石英比色皿测定的计算公式如下

1．按照蛋白浓度计算

酶活性定义：每毫克蛋白每分钟氧化1nmol底物ABTS所需的酶量为一个酶活力单位。

漆酶活性（nmol/min /mg prot）= ×V反总÷（V样×Cpr）÷T= 9.26×△A÷Cpr

2．按照样本质量计算

酶活性定义：每克样品每分钟氧化1nmol底物ABTS所需的酶量为一个酶活力单位。

漆酶活性（nmol/min /g 鲜重）= ×V反总÷（V样×W÷V样总）÷T= 9.26×△A÷W

3．按照细胞数量计算

酶活性定义：每104个细胞每分钟氧化1nmol底物ABTS所需的酶量为一个酶活力单位。

漆酶活性（nmol/min /104 cell）= ×V反总÷（V样×细胞数量÷V样总）÷T= 9.26×△A÷细胞数量

4．按照液体体积计算

酶活性定义：每升培养液每分钟氧化1nmol底物ABTS所需的酶量为一个酶活力单位。

漆酶活性（nmol/min /L）= ×V反总÷V样÷T= 9260×△A

ε：ABTS毫摩尔消光系数：36L/mmol/cm；d：比色皿光径，1cm；V反总：反应总体积，0.3mL；V样：反应体系中样本体积，0.03mL；V样总：加入提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W，样本质量，g；T：反应时间，20min

b. 用96孔板测定的计算公式如下

1．按照蛋白浓度计算

酶活性定义：每毫克蛋白每分钟氧化1nmol底物ABTS所需的酶量为一个酶活力单位。

漆酶活性（nmol/min /mg prot）= ×V反总÷（V样×Cpr）÷T= 18.52×△A÷Cpr

2．按照样本质量计算

酶活性定义：每克样品每分钟氧化1nmol底物ABTS所需的酶量为一个酶活力单位。

漆酶活性（nmol/min /g 鲜重）= ×V反总÷（V样×W÷V样总）÷T= 18.52×△A÷W

3．按照细胞数量计算

酶活性定义：每104个细胞每分钟氧化1nmol底物ABTS所需的酶量为一个酶活力单位。

漆酶活性（nmol/min /104 cell）= ×V反总÷（V样×细胞数量÷V样总）÷T

= 18.52×△A÷细胞数量

4．按照液体体积计算

酶活性定义：每升培养液每分钟氧化1nmol底物ABTS所需的酶量为一个酶活力单位。

漆酶活性（nmol/min /L）= ×V反总÷V样÷T= 18520×△A

ε：ABTS毫摩尔消光系数：36L/mmol/cm；d：比色皿光径，0.5cm；V反总：反应总体积，0.3mL；V样：反应中样本体积，0.045mL；V样总：加入提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W，样本质量，g；T：反应时间，20min

木质素（Lignin）含量试剂盒说明书

微量法  100管/96样

注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义

木质素是构成植物细胞壁的成分之一，是由聚合的芳香醇构成的一类物质，存在于木质组织中，主要作用是通过形成交织网来硬化细胞壁。木质素主要位于纤维素纤维之间，起抗压作用。

测定原理

木质素中的酚羟基发生乙酰化后在280nm处有特征吸收峰，280nm的吸光值高低与木质素含量正相关。

需自备的仪器和用品、

天平、40目筛，玻璃试管、烧杯、离心机，恒温水浴锅、封口膜、烘箱、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板(UV板)、高氯酸，浓硫酸。

试剂组成和配制

取200μL于微量石英比色皿/96孔板，测定280nm处吸光值A。分别记为A空白管和A测定管，ΔA=A测定管-A空白管

计算公式

标准曲线：y = 0.0347x+0.0068，R2=0.9889

Lignin（mg/g干重）= (ΔA-0.0068)÷0.0347×V反总×10-3÷W×T=0.0294×(ΔA-0.0068) ÷0.002×50

V反总：反应总体积：1.02mL；W：样本质量，g；T：稀释倍数

注意事项

1.试剂一有毒性，请操作时做好防护措施，加热前必须用封口膜密封，以防气体溢出。

2.加热过程中有剧烈反应，震荡时轻摇，以免压力过大喷出造成人身伤害。

3.试剂三具有强刺激性，建议操作过程全部在通风橱子操作。