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产品名称 | 检测方法 | 规格 | 货号 |
糖原合成酶(Glycogen synthase,GCS)试剂盒 | 微量法 | 100管/96样 | CS-01S63661 |
注意:正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
GCS(EC
测定原理:
GCS催化UDPG和葡萄糖残基生成糖原和UDP,丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶进一步依次催化NADH氧化生成NAD+,在340nm下测定NADH下降速率,即可反映GCS活性。
需自备的仪器和用品:
分光光度计/酶标仪、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。
试剂的组成和配制:
提取液:100mL×1瓶,4℃保存;
试剂一:液体18 mL×1瓶, 4℃保存;
试剂二:液体2.5mL×1瓶,4℃保存;
试剂三:液体16.4uL×1支,4℃保存;
试剂四:粉剂×1支, -20℃保存;
试剂五:粉剂×1支, -20℃保存;
样本的前处理:
按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL提取液),进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
测定步骤:
1、分光光度计或酶标仪预热30min以上,调节波长至340nm,蒸馏水调零。
2、工作液的配制:临用前将试剂三和试剂四转移到试剂一中混合溶解待用;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。
3、试剂五的配制:临用前在试剂五中加入1mL试剂二充分溶解待用;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。
4、将工作液和试剂五置于37℃预热5分钟。
5、在1mL微量石英比色皿或96孔板中加入10μL样本、10μL试剂五和180μL工作液,立即混匀,记录340nm处初始吸光值A1和1min后的吸光值A2,计算ΔA=A1-A2。
注意:在该试剂盒中,若ΔA大于0.1,需将样本用提取液稀释适当倍数后测定,使ΔA小于0.1可提高检测灵敏度。计算公式中乘以相应稀释倍数。
GCS活性计算:
a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下
(1)按样本蛋白浓度计算
单位定义:每mg组织蛋白每分钟消耗1nmol NADH定义为一个酶活力单位。
GCS(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样×Cpr) ÷T=3215×ΔA÷Cpr
(2)按样本鲜重计算
单位定义:每g组织每分钟消耗1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。
GCS(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(W ×V样÷V样总)÷T=3215×ΔA÷W
V反总:反应体系总体积,2×10-4 L;ε:NADH摩尔消光系数,6.22×103 L / mol /cm;d:比色皿光径,1cm;V样:加入样本体积,0.01 mL;V样总:加入提取液体积,1 mL;T:反应时间,1 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g。
b.用96孔板测定的计算公式如下
(1)按样本蛋白浓度计算
单位定义:每mg组织蛋白每分钟消耗1nmol NADH定义为一个酶活力单位。
GCS(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样×Cpr) ÷T=6430×ΔA÷Cpr
(2)按样本鲜重计算
单位定义:每g组织每分钟消耗1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。
GCS(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(W ×V样÷V样总)÷T=6430×ΔA÷W
V反总:反应体系总体积,2×10-4 L;ε:NADH摩尔消光系数,6.22×103 L / mol /cm;d:96孔板光径,0.5cm;V样:加入样本体积,0.01mL;V样总:加入提取液体积,1 mL;T:反应时间,1 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g。
1. 本产品仅供科研使用。请勿用于医药、临床诊断或治疗,食品及化妆品等用途。请勿存放于普通住宅区。
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