测定原理

滤纸酶水解滤纸产生的还原糖能与3,5-二硝基水杨酸生成红棕色氨基化合物，在540nm处有最大光吸收，在一定范围内反应液颜色深浅与还原糖的量成正比，可测定计算得滤纸酶的活力。

自备实验用品及仪器

天平、研钵、低温离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、恒温水浴锅。

试剂组成和配制

试剂一：液体25mL×1瓶，4℃保存。

试剂二：液体40mL×1瓶，4℃保存。

滤纸条：50mg×50条。

酶液提取

1.组织：按照质量（g）：蒸馏水体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g，加入1mL蒸馏水）加入蒸馏水，冰浴匀浆后于4℃，12000rpm离心10min，取上清置于冰上待测。

2.细胞：按照细胞数量（104个）：蒸馏水体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后4℃，12000rpm离心10min，取上清置于冰上待测。

3.培养液或其它液体：直接检测。

测定操作

1.根据样本数量取两倍数量的滤纸条和Ep管，每支Ep管中放入一个卷状滤纸条（注意要放入底部），作为底物。

2.对照管：取200μL灭活的酶液，加入500μL试剂一，充分混匀，再加入放有滤纸条的Ep管中，标注为对照管。

3.测定管：取200μL酶液，加入500μL试剂一，充分混匀，再加入放有滤纸条的Ep管中，标注为测定管。

4.对照管和测定管同时置于50℃水浴锅中反应30min。

5.加入800μL试剂二，沸水浴5min，自来水冷却后取200μL于微量石英比色皿/96孔板中测定540nm处吸光值，分别记为A对照管和A测定管，△A= A测定管- A对照管。

酶活性计算公式

a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下

标准曲线：y = 0.2805x - 0.0255，R2 = 0.9991

（1）按照蛋白浓度计算

酶活性定义：在50℃，pH4.6条件下，每毫克蛋白每分钟分解滤纸产生1mg葡萄糖所需的酶量为一个酶活力单位。

FPA（U/mg prot）=（△A+0.0255）÷ 0.2805×V反总÷（V样×Cpr）÷T

= 0.891×（△A+0.0255）÷ Cpr

（2）按照样本质量计算

酶活性定义：在50℃，pH4.6条件下，每克组织每分钟分解滤纸产生1mg葡萄糖所需的酶量为一个酶活力单位。

FPA（U/g）=（△A+0.0255）÷ 0.2805×V反总÷（W×V样÷V样总）÷T

= 0.891×（△A+0.0255）÷ W

（3）按液体体积计算

酶活性定义：在50℃，pH4.6条件下，每毫升培养液每分钟分解滤纸产生1mg葡萄糖所需的酶量为一个酶活力单位。

FPA（U/mL）=（△A+0.0255）÷ 0.2805×V反总÷V样÷T

= 0.891×（△A+0.0255）

（4）按细胞数量计算

酶活性定义：在50℃，pH4.6条件下，每104个细胞每分钟分解滤纸产生1mg葡萄糖所需的酶量为一个酶活力单位。

FPA（U/104cell）=（△A+0.0255）÷ 0.2805×V反总÷（V样×细胞数量（万个）÷V样总）÷T

= 0.891×（△A+0.0255）÷ 细胞数量（万个）

V反总：反应总体积，1.5mL，V样：反应体系中加入样本体积，0.2mL；V样总：加入提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g；T：反应时间，30min

b.用96孔板测定的计算公式如下

标准曲线：y = 0.1403x - 0.0255，R2 = 0.9991

（1）按照蛋白浓度计算

酶活性定义：在50℃，pH4.6条件下，每毫克蛋白每分钟分解滤纸产生1mg葡萄糖所需的酶量为一个酶活力单位。

FPA（U/mg prot）=（△A+0.0255）÷ 0.1403×V反总÷（V样×Cpr）÷T

=1.782×（△A+0.0255）÷ Cpr

（2）按照样本质量计算

酶活性定义：在50℃，pH4.6条件下，每克组织每分钟分解滤纸产生1mg葡萄糖所需的酶量为一个酶活力单位。

FPA（U/g）=（△A+0.0255）÷ 0.1403×V反总÷（W×V样÷V样总）÷T

= 1.782×（△A+0.0255）÷ W

（3）按液体体积计算

酶活性定义：在50℃，pH4.6条件下，每毫升培养液每分钟分解滤纸产生1mg葡萄糖所需的酶量为一个酶活力单位。

FPA（U/mL）=（△A+0.0255）÷ 0.1403×V反总÷V样÷T

= 1.782×（△A+0.0255）

（4）按细胞数量计算

酶活性定义：在50℃，pH4.6条件下，每104个细胞每分钟分解滤纸产生1mg葡萄糖所需的酶量为一个酶活力单位。

FPA（U/104cell）=（△A+0.0255）÷ 0.1403×V反总÷（V样×细胞数量（万个）÷V样总）÷T

= 1.782×（△A+0.0255）÷ 细胞数量（万个）

V反总：反应总体积，1.5mL，V样：反应体系中加入样本体积，0.2mL；V样总：加入提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g；T：反应时间，30min

注意事项

1.用干净的镊子取出滤纸条，带手套卷成卷放入Ep管底部。

2.样本灭活时保证同一批样本处理时间一致，建议沸水浴十分钟。

3.批量样本测定之前先做1-2个样本的预实验，若吸光值超过1.2，建议将样本用蒸馏水稀释后再进行测定，计算公式中乘以稀释倍数。

4.显色后取检测液时注意枪头不要碰到滤纸条，以免带入毛状物，影响测定结果。