测定原理：

糜蛋白酶催化ATEE水解，产物在237 nm有特征光吸收；通过测定237 nm 光吸收增加速率，来计算糜蛋白酶活性。

自备仪器和用品：

台式离心机、水浴锅、可调式移液器、研钵、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板(UV板)、冰和蒸馏水。

试剂组成和配制：

试剂一：液体100mL×1瓶，4℃保存。

试剂二：粉剂×1瓶，4℃避光保存。临用前加入20 mL蒸馏水充分溶解。

粗酶液提取：

组织样品：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL试剂一）冰浴匀浆，8000g，4℃离心10min，取上清，即粗酶液。

测定步骤：

1. 分光光度计/酶标仪预热30min，调节波长到237 nm，蒸馏水调零。

2. 试剂二置于37℃水浴中保温30min。

3. 空白管：取微量石英比色皿/96孔板，加入20μL试剂一，200μL试剂二，混匀于237nm测定4min内吸光值变化，记为△A空白管。（从吸光值稳定增加开始计时）

4. 测定管：取微量石英比色皿/96孔板，加入20μL粗酶液，200μL试剂二，混匀于237nm测定4min内吸光值变化，记为△A测定管。（从吸光值稳定增加开始计时）

注意：空白管只需要测定一次。

糜蛋白酶活性计算公式：

a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下

（1）按蛋白浓度计算

活性单位定义：25℃每毫克蛋白每分钟催化吸光值增加1为一个酶活单位。

糜蛋白酶（U/mg prot）= (△A测定管－△A空白管) ×V反总÷(Cpr×V1)÷T

=2.75×(△A测定管－△A空白管)÷Cpr

（2）按样本质量计算

活性单位定义：25℃每克样品每分钟催化吸光值增加1为一个酶活单位。

糜蛋白酶（U/g 鲜重）=(△A测定管－△A空白管) ×V反总÷(W×V1÷V2)÷T

=2.75×(△A测定管－△A空白管)÷W

W：样品质量（g）；Cpr：粗酶液蛋白质浓度（mg/mL），需要另外测定；V1：加入反应体系中粗酶液体积（mL），20μL=2×10-2 mL；V2：粗酶液总体积（mL），1 mL；V反总：反应总体积，220μL=0.22mL； T：反应时间（min），4min。

b.使用96孔板测定的计算公式如下

（1）按蛋白浓度计算

活性单位定义：25℃每毫克蛋白每分钟催化吸光值增加1为一个酶活单位。

糜蛋白酶（U/mg prot）= (△A测定管－△A空白管) ×V反总÷(Cpr×V1)÷T

=2.75×(△A测定管－△A空白管)÷Cpr

（2）按样本质量计算

活性单位定义：25℃每克样品每分钟催化吸光值增加1为一个酶活单位。

糜蛋白酶（U/g 鲜重）=(△A测定管－△A空白管) ×V反总÷(W×V1÷V2)÷T

=2.75×(△A测定管－△A空白管)÷W

W：样品质量（g）；Cpr：粗酶液蛋白质浓度（mg/mL），需要另外测定；V1：加入反应体系中粗酶液体积（mL），20μL=2×10-2 mL；V2：粗酶液总体积（mL），1 mL；V反总：反应总体积，220μL=0.22mL； T：反应时间（min），4min。

注意事项：

临用前配制的试剂配置好后3天内使用完毕。