测定原理：

胰蛋白酶催化水解TAME的酯键，释放出的游离羧基与反应体系中的氢氧化钠发生中和反应，导致溶液的pH值降低，以苯酚红为指示剂，测定溶液在555nm处吸收值的变化，可以快速测得胰蛋白酶活性数据。胰蛋白酶在一定范围内与555nm处吸收值的降低呈良好的线性关系。

自备仪器和用品：

紫外可见分光光度计、1mL玻璃比色皿、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、研钵、冰和蒸馏水。

试剂组成和配制：

提取液：液体60 mL×1瓶，4℃保存。

试剂一：液体10 mL×1瓶，4℃保存。

试剂二：液体10mL×1瓶，4℃避光保存。

试剂三：液体4 mL×1瓶，4℃保存。

粗酶液提取：

1.组织样品：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液）冰浴匀浆，10000g，4℃离心10min，取上清，即粗酶液。

测定步骤：

1. 分光光度计预热30 min，调节波长到555 nm，蒸馏水调零。

2. 工作液的配制：临用前根据用量按照试剂一（V）：试剂二（V）：蒸馏水（V）：试剂三（V）=1 mL：1 mL：5.4 mL：0.4 mL的比例充分混合。（注意：现用现配，用多少配多少，在空瓶中配制，试剂盒中带有4个空瓶）

3. 吸取25μL样本，加入975 μL工作液，混匀后立即测定，记录555nm下1min时的吸光值A1和2min时的吸光值A2。计算△A=A1-A2

注意：如果△A小于0.005，可将反应时间延长到5min。如果△A大于0.5，体系迅速变色，可将样本用提取液稀释后测定（建议稀释10倍），计算公式中乘以相应稀释倍数。

胰蛋白酶活性计算公式：

使用石英比色皿测定的计算公式如下

（1）按蛋白浓度计算

活性单位定义：室温下每毫克蛋白质每分钟催化555nm处吸光值减少1为1个酶活单位。

胰蛋白酶（U/mg prot）= △A ×V反总 ÷（Cpr×V1）÷T

=40×△A ÷Cpr

（2）按样本质量计算

活性单位定义：室温每克组织每分钟催化555nm处吸光值减少1为1个酶活单位。

胰蛋白酶（U/g 鲜重）= △A×V反总÷（W×V1÷V2）÷T

=40×△A ÷W

Cpr：粗酶液蛋白质浓度（mg/mL），需要另外测定；W：组织质量（g）；V1：加入反应体系中粗酶液体积（mL），25 μL=0.025 mL；V2：粗酶液总体积（mL），1 mL；V反总：反应总体积，1 mL；T：反应时间（min），1 min。