测定原理

强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物；紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。该方法测定范围为1~10mg蛋白质，适用于蛋白质浓度高的样品，尤其是动物材料。

自备仪器和用品

离心机、可见分光光度计、移液器、1 mL玻璃比色皿和蒸馏水。

试剂组成和配制

试剂一：液体50mL×1瓶，4℃保存。

标准品：液体1mL×1瓶，5 mg/mL，4℃保存。

样品中可溶性蛋白质提取

1.液体样品：澄清无色液体样品可以直接测定。

2.组织样品：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液（自备，根据需要选用酶提取缓冲液或者蒸馏水或者生理盐水））

冰浴匀浆，8000g，4℃离心10min，取上清，即待测液。（动物样品常常需要稀释）

3.细菌、真菌：按照细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后8000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。

测定操作

1. 分光光度计预热30 min，调节波长到540 nm，蒸馏水调零。

2. 空白管：取1 mL玻璃比色皿，加入200μL蒸馏水，1000μL试剂一，混匀后室温静置15 min，于540nm比色，记为A空白管。

3. 标准管：取1 mL玻璃比色皿，加入200μL标准液，1000μL试剂一，混匀后室温静置15 min，于540 nm比色，记为A标准管。

4. 测定管：取1 mL玻璃比色皿，加入200μL待测液，1000μL试剂一，混匀后室温静置15 min，于540nm比色，记为A测定管。

注意：空白管和标准管只需测定一次。

样品中蛋白质浓度计算公式

C待测（mg/mL）= C标准管×(A测定管－A空白管)÷(A标准管－A空白管)

=5×(A测定管－A空白管)÷(A标准管－A空白管)

注意事项：

1.样品蛋白浓度须在1~10mg/ml范围内，低于1mg/ml不能用此法，高于10mg/ml须做相应稀释。因此测定前用1~2个样做预实验，确保蛋白浓度在1~10mg/ml范围内。

2.待测样品蛋白提取可用生理盐水、双蒸水或不含蛋白的PBS提取。该法受硫酸铵、Tris缓冲液干扰，提取液中应不含这些物质；否则改用BCA蛋白质含量测定试剂盒。